Intermedin对小鼠MC3T3-E1细胞增殖、凋亡、分化及RANKL/OPG/M-CSF表达的影响

摘要

目的：
　　骨重建是人体健康骨组织的重要生理程序，它由骨形成和骨吸收共同完成。骨形成主要通过成骨细胞的增殖、分化来实现，而骨吸收则是由破骨细胞来完成，二者相互影响，维持一种平衡的生理状态。当这种平衡被破坏以后会导致多种病理情况，其中就包括骨质疏松。
　　现已研究发现的降钙素基因相关肽超家族包括7个成员:降钙素(Calcitonin，CT)胰淀粉酶(Amylin)，两种降钙素基因相关肽(CGRP)，肾上腺髓质素(Adrenomedullin，AMD)，降钙素受体刺激肽(calcitonin receptor-stimulating peptide，CRSP)以及垂体中介素(Intermedin，IMD)。Intermedin(IMD)是最近发现的降钙素基因相关肽家族的新成员，它在人体很多组织都有表达，比如:胃肠道、肺、下丘脑、肾上腺及心脏等组织器官。与其他降钙素基因家族相关肽成员相似，IMD通过与降钙素样受体CRLR结合激活受体活化蛋白RAMP1/RAMP2/RAMP3发挥生物学效用。它对骨吸收的作用与降钙素(CT)和降钙素基因相关肽(CGRP)的作用相似，都可以抑制骨吸收，但是它的作用机制还没有被完全研究透彻。
　　本实验采用不同浓度的IMD(0、1、10和100nM）干预小鼠MC3TC-E1成骨细胞，通过MTT、流式细胞仪、real time PCR和western blot等试验方法检测IMD对MC3TC-E1细胞的增殖、分化、凋亡及RANKL/OPG/M-CSF表达的影响，进一步完善IMD对骨重建的影响机制。
　　材料和方法：
　　1、材料
　　(1)细胞系小鼠成骨细胞系MC3T3-E1(ATCC)。
　　(2)主要试剂 Intermedin/IMD（美国凤凰制药）、AnnexinⅤ-FITC/PI(BD)、MTT试剂盒(sigma)，Caspase-3活性试剂盒(Promega) OPG、RANKL、M-CSF和Caspase-3抗体(santa)，引物和PCR试剂盒(TaKaRa)。
　　2、实验方法
　　(1)不同浓度IMD干预小鼠MC3T3-E1细胞，应用MTT方法检测IMD对成骨细胞增殖的影响;
　　(2)无血清或者地塞米松诱导MC3T3-E1细胞凋亡，同时加入不同浓度IMD干预，应用流式细胞术检测IMD对成骨细胞凋亡;
　　(3)不同浓度IMD干预MC3T3-E1细胞，应用Real time PCR技术检测OCN，BSP及RANKL/OPG/M-CSF nRNA的表达;
　　(4)不同浓度IMD干预MC3T3-E1细胞，应用Western blot方法检测Caspase-3，RANKL/OPG/M-CSF蛋白的表达;
　　(5)细胞培养技术培养MC3T3-E1细胞系;
　　(6)成骨诱导分化，同时加入不同浓度的IMD干预，应用茜素红染色和ALP活性测定检测成骨细胞分化。
　　3、统计学分析
　　应用SPSS19.0统计软件对数据进行分析，数据以Mean±SD表示，采用t检验和单因素方差分析的统计方法，P＜0.05差异具有统计学意义。
　　结果：
　　1、细胞增殖不同浓度IMD干预MC3T3-E1细胞后，采用MTT法检测细胞的增值率，结果显示不同浓度IMD组与空白对照组的增值率无统计学差异。
　　2、细胞分化不同浓度IMD干预MC3T3-E1细胞后，结果显示不同浓度IMD组与空白对照组的ALP活性、OCN/BSP mRNA表达和茜素红染色均无统计学差异。
　　3、细胞凋亡不同浓度IMD干预无血清或者10-7M地塞米松诱导细胞凋亡后，100nM IMD组较无血清组或10-7 M地塞米松组的annexinⅤ/PI染色率和Caspase-3活性显著降低(p＜0.01)。
　　4、RANKL/OPG/M-CSF不同浓度IMD干预MC3T3-E1细胞后，100nM IMD组的RANKL及M-CSF表达量显著低于对照组，OPG的表达量显著高于对照组(p＜0.01)。
　　结论：
　　1、IMD对MC3T3-E1细胞的增殖和分化无影响;
　　2、IMD可以抑制地塞米松和无血清诱导的MC3T3-E1细胞凋亡。
　　3、IMD通过降低MC3T3-E1细胞RANKL/OPG的比率及抑制M-CSF的分泌来抑制破骨细胞的活性从而抑制骨吸收。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 降钙素基因家族相关肽成员对骨代谢调节的研究进展

在学期间的科研成绩

致谢

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