Claudin1/7蛋白的表达与鼻咽癌侵袭的相关性的研究及低氧和低氧后复氧对其表达的影响

摘要

目的：鼻咽癌好发于鼻咽腔顶部和侧壁，是我国高发恶性肿瘤之一，约占全球鼻咽癌总发病率的80％。其发病具有明显的地域性，由南到北逐渐降低，以南方的广东、广西、湖南等省最高。目前尚不明确鼻咽癌的病因，EB病毒的感染、环境因素及吸烟和遗传等因素等被认为是可能的致癌因素。鼻咽癌的早期临床体征多不明显，主要有鼻塞、涕中带血等，79.37％的患者以颈部淋巴结肿大为首发体征。病理学调查显示，鼻咽癌98％的属于低分化的鳞状细胞癌，具有较高的侵袭性，而高分化鳞癌、腺癌、泡状核细胞癌等较少。多数的鼻咽癌对放射治疗具有中度敏感性，放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方法。但是，对于对放射治疗不敏感的一部分低分化的鳞癌、高分化鳞癌，癌细胞的颅内侵袭和淋巴结转移、远处播散是主要的死亡原因。封闭连接、通讯连接和锚定连接是细胞间的存在的三种主要连接方式。紧密连接(tightjunction)有两种英文名称，同一个意思:(tightjunction，zonulaoccludens)和不通透连接(impermeablejunction)，属于封闭连接中的一种，通常位于上皮顶端两相邻细胞间，主要作用是封闭相邻上皮细胞间的接缝，从而防止溶液中的分子沿细胞间隙渗入体内，保证了机体内环境的相对稳定。封闭连接主要的跨膜蛋白为claudin和occludin，另外还有膜的外周蛋白ZO。Claudins蛋白作为封闭连接中的重要组成部分，目前已发现有20多种，分子量约20-27KD。Claudins蛋白作为跨膜蛋白，每一个蛋白分子都由4个跨膜结构域组成，其中疏水的氨基和富含丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羧基末端位于细胞内。Claudins蛋白主要通过蛋白激酶途径实现细胞连接处的选择渗透性的调节功能，而基因突变或其他原因引起的Claudin的改变，都可以导致上皮细胞间的极性及紧密连接破坏的破坏，从而影响上皮细胞两个不同环境之间的渗透压。因为封闭连接普遍存在于脑毛细血管内皮、消化道上皮、膀胱上皮和睾丸支持细胞之间，所以早期对于Claudins蛋白的研究主要集中在生殖系统疾病、血脑屏障和神经系统等方面。近年来越来越多的研究表明，Claudins蛋白的表达异常与许多肿瘤的发生发展密切相关。并且，研究发现同一种Claudin蛋白在不同肿瘤的抑癌或促癌作用可能并不相同。
　　方法：选取中国医科大学第一附属医院病理科于2013年4月-2015年4月之间，诊断为鼻咽癌的组织切片66例，其中分化型的组织标本40例，未分化型的组织标本26例。通过免疫组化染色的方法分析对比Claudin1/Claduin7在不同分化程度的石蜡组织标本中的表达差异。于中国医科院肿瘤细胞库购买高、低分化的鼻咽癌细胞系CNE1和CNE2，采用RT-PCR和Western blot检测并对比Claudin1/Claduin7在不同分化程度的鼻咽癌细胞中的基因及蛋白水平的表达差异。通过向鼻咽癌细胞中转染小干扰RNA，抑制癌细胞中Claudin1/Claduin7的表达，进一步观察他们对细胞迁移及侵袭的影响。将鼻咽癌细胞系置于氧浓度为0.1％的低氧培养箱中培养，检测细胞中这两种基因的变化及低氧对肿瘤细胞的生物特性的影响，包括:细胞增值、细胞的迁移与侵袭、细胞周期的改变。研究以上变化涉及的可能的分子机制。进一步研究细胞在低氧复氧后的以上相关基因的变化。
　　结果：⑴Claudin-7在未分化的鼻咽癌组织中表达较分化型鼻咽癌组织高。⑵Claudin-1、Claudin-7在低分化的CNE2细胞中表达较高。⑶Transwell实验显示CNE2细胞的迁移能力明显大于CNE1。⑷CNE2细胞中Claudin7的沉默可以抑制细胞的迁移和侵袭，Claudin1的沉默对细胞的侵袭和迁移没有影响。⑸对鼻咽癌细胞进行低氧处理，可以影响癌细胞的生物学特性，包括:可使CNE1细胞的增殖加速、迁移和侵袭能力降低，细胞周期中G1期缩短，S期延长;可使CNE2细胞增殖减速，迁移和侵袭能力增强、细胞周期中G1期延长，S期缩短。⑹RT-PCR和Western blot结果显示在低氧环境下，CNE2细胞中:HIF1a的表达升高，Claudin1的表达下降，Claudin7的表达增高;CNE1细胞对低氧的不敏感，HIF1a的表达下降，Claudin1的表达下降，Claudin7的表达下降。⑺RT-PCR和Western blot结果显示在低氧环境下，CNE2细胞中P18表达增高，CNE1细胞中的p18表达下降。⑻采用小干扰RNA技术，进行相关分子机制的研究发现：靶向抑制HIF1a的表达可使Claudin1的表达增加，Claudin7的表达下降；Claudin1基因的沉默明显促进Claudin7的表达；Claudin7的沉默则可使Claudin1表达下降，并同时抑制P18的表达。⑼缺氧后复氧处理，RT-PCR和Western blot结果显示可使CNE2细胞中，Claudin1表达增加，Claudin7及P18表达下降。
　　结论：①Claduin7在未分化的鼻咽癌组织及CNE2细胞株中的表达明显高于分化型组织及CNE1细胞株，抑制CNE2中Claudin7的表达可以降低其迁移和侵袭能力。②低氧环境下，癌细胞中的HIF1a蛋白可以在基因水平直接调控两种基因的表达，并通过Claudin7，间接影响P18的表达，影响细胞的增殖。③缺氧后复氧，可以明显抑制鼻咽癌细胞的侵袭，但是同时可能促进细胞的增殖。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：Claudin1／7蛋白的表达与鼻咽癌侵袭的相关性的

1 前言

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 实验结果

3．1 Claudin-7在未分化的鼻咽癌组织中表达较分化型鼻咽癌组织高

3．2 Claudin-1、Claudin-7在低分化的CNE2细胞中表达较高

3．3 Transwell实验显示CNE2细胞的迁移能力明显大于CNE1

3．4 CNE2细胞中Claudin7的沉默可以抑制细胞的迁移和侵袭，Claudin1的沉默对细胞的侵袭和迁移没有影响

4 讨论

5 结论

第二部分：低氧对鼻咽癌细胞的侵袭和迁移的影响

6 前言

7．1 实验材料

7．2 实验方法

8 实验结果

8．2 低氧环境下CNE1细胞的迁移和侵袭性轻度下降，而CNE2细胞的明显增加

8．3 低氧环境中CNE1／CNE2的细胞周期的改变

9 讨论

10 结论

第三部分：低氧和低氧后复氧对鼻咽癌细胞中的Claudin1／7表达的影响及相关分子机制的研究

11 前言

12．1 实验材料

12．2 实验方法

13 实验结果

13．3 0．1％的低氧环境中，鼻咽癌细胞中P18的表达会发生明显的变化

13．4 相关分子机制的研究

13．5 低氧培养的鼻咽癌细胞，复氧后细胞的侵袭能力明显下降

14 讨论

15 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 缺氧微环境对实体癌发生发展的影响

在学期间科研成绩

致谢

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