P21活化激酶4在乳头状甲状腺癌发生发展中的作用及其机制的研究

摘要

目的：
　　甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤之一，其发病率预计到2030年将跃居全世界范围内肿瘤发病率的第四位[1]。乳头状甲状腺癌是最常见的分化型甲状腺癌，尽管乳头状甲状腺癌具有较好的预后，但其复发与甲状腺癌的逐年上升的死亡率密切相关[2]。某些关键蛋白在肿瘤的发生和发展中起到重要的作用，因此，鉴定在其疾病恶性进程中的关键蛋白对甲状腺癌的防治有着重大的意义。
　　P21活化激酶是一类在进化上高度保守的丝、苏氨酸蛋白激酶家族，是第一个被鉴定做为Rho-GTPase信号的下游主要靶蛋白，到目前为止，p21活化激酶家族共发现有6个主要成员，根据其结构和活化方式的不同，可以将其分为两类，其中Ⅰ类PAK包括PAK1、PAK2、PAK3，Ⅱ类PAK包括PAK4、PAK5、PAK6[3]。
　　PAK4有着重要的生物学功能，其中包括调节微管的不稳定性[4-5]，抑制细胞发生凋亡和细胞粘附[6-7]，促进细胞迁移能力[8-10]、以及肿瘤生成[11]和肿瘤细胞的锚定非依赖性生长[12]。同时，研究发现PAK4在多种肿瘤细胞株和组织中呈高表达，包括乳腺癌、前列腺癌、胃癌、胆囊癌和卵巢癌等，同时越来越多的研究表明PAK4的高表达的与肿瘤的恶性进程密切相关，这也提示我们PAK4可能成为肿瘤诊断和治疗潜在的靶标[12-15]。
　　最近有研究表明活性氧(ROS)在多种细胞生物学行为的信号转导通路中起到重要的作用[16-17]。而这种异常的活性氧信号可以引起细胞周期[18]、迁移、侵袭[19]及肿瘤形成等多种生理和病理性变化密切相关。人们在多种不同的肿瘤细胞株和组织中检测到活性氧水平的升高[20]。甲状腺癌和氧化应激间的关系已经被证实，然而其发生的分子机制仍需要进一步阐明[21-22]。
　　促甲状腺激素(TSH)在临床发现的甲状腺癌的发生发展中起到关键的作用[23]。TSH与其受体TSHR结合后，TSH可以促进cAMP的产生，其可以维持甲状腺激素的分泌和甲状腺细胞的增殖[24]。在分化型甲状腺癌中，TSH的刺激与肿瘤的生长密切相关，而当抑制TSH水平后，肿瘤的生长也被抑制，这些发现提示我们分化型甲状腺癌是一种TSH依赖性的肿瘤[2S-26]。
　　在我们的研究中证实了PAK4在乳头状甲状腺癌中的作用，这一发现可能揭示PAK4在ROS和TSH所诱导的乳头状甲状腺癌中扮演重要的角色。
　　方法：
　　在本研究中我们收集了在2011年至2013年期间在中国医科大学附属第一医院临床病理诊断为PTC且经过甲状腺外科手术治疗的98例临床病例，其中男性27例，女性71例。我们首先通过免疫组化的方法检测了98例乳头状甲状腺癌患者肿瘤组织中PAK4和p-PAK4ser474的表达，并探讨其与乳头状甲状腺癌的临床病理特征之间的关系。同时，我们也通过Western blot实验检测了乳头状甲状腺癌和其癌旁正常组织中PAK4和p-PAK4ser474的表达情况。接下来，我们通过慢病毒感染的方法构建了稳定沉默PAK4的乳头状甲状腺癌细胞株TPC1和K1。进一步我们通过细胞增殖实验、迁移和侵袭实验验证了PAK4在乳头状甲状腺癌中的生物学行为。通过NAC中和细胞内的ROS，我们通过Western blot检测了ROS对于PAK4表达情况的影响。并且通过细胞增殖实验、迁移和侵袭实验进一步验证ROS对PAK4表达调控的生物学功能。通过Western blot实验，我们检测了TSH对PAK4第474位丝氨酸活化的影响，并且进一步通过U0126(MEK1/2抑制剂)，SB203580(p38MAPK抑制剂)，H89(PKA抑制剂)，SP600125(c-JunN terminal kinase抑制剂)以及wortmannin(phosphoinositide3-kinase抑制剂)明确TSH活化PAK4的信号通路。进一步，我们通过细胞增殖实验证实了TSH活化PAK4的生物学功能。
　　SPSS17.0统计分析软件进行数据处理分析，应用非参数检验Mann-Whitney Utest进行分类变量的比较。相关分析采用Spearman's rank correlation tests相关分析。数值变量数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，两组数据的比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　在本研究中，我们证实了PAK4在PTC恶性进程中的重要作用。首先，我们通过对98例乳头状甲状腺癌和癌旁正常组织的免疫组化染色发现，PAK4及p-PAK4ser474在乳头状甲状腺癌中呈现高表达，其中PAK4的阳性率为90.8％，p-PAK4ser474的阳性率为82.7％。在正常甲状腺组织中PAK4及p-PAK4ser474呈阴性表达。此外，我们通过Western blot方法检测了PAK4和p-PAK4(Ser474)在乳头状甲状腺癌和癌旁正常组织中的表达情况，发现PAK4和p-PAK4(Ser474)在乳头状甲状腺癌中呈高表达。进一步，我们通过非参数检验发现PAK4和p-PAK4的表达与乳头状甲状腺癌的肿瘤大小，甲状腺癌的腺外侵袭以及TNM分期呈现正相关，而与性别，年龄和淋巴结转移无关。
　　为了进一步研究PAK4在乳头状甲状腺癌中的生物学功能，我们通过RNA干扰构建了稳定沉默PAK4的乳头状甲状腺癌细胞株TPC-1和K1。Western blot显示与对照细胞相比，两个独立靶序列均能够下调PAK4的表达。进一步，我们发现沉默PAK4能够显著的抑制乳头状甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
　　我们的结果显示NAC中和乳头状甲状腺癌细胞中的ROS，能够下调PAK4的表达水平。另外，我们发现NAC能够抑制乳头状甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭作用。进一步，我们发现ROS的这一作用依赖于PAK4的表达。
　　因为TSH在乳头状甲状腺癌的发生、发展中起到重要的作用，我们进一步检查了TSH是否可以激活PAK4信号通路。我们发现TSH可以以时间依赖性的方式激活PAK4的第474位丝氨酸。为了进一步解析TSH活化PAK4第474位点的机制，我们分别使用MEK1/2的抑制剂U0126，p38MAPK的抑制剂SB203580，PKA的抑制剂H89，JNK的抑制剂SP600125，以及PI3K的抑制剂wortmannin，我们发现PKA的抑制剂H89能够抑制TSH对PAK4第474位丝氨酸的活化。另一方面，我们沉默了PKA的催化亚基，也可以抑制TSH对于PAK4第474位丝氨酸的活化。这一发现提示我们TSH对于PAK4的活化是通过PKA信号通路。因为TSH可以活化其受体TSHR，进而活化cAMP信号通路，我们接下来想检测是否cAMP可以诱导PAK4第474位的磷酸化。Forskolin可以通过激活腺苷酸环化酶的活性，进而提高细胞内cAMP的水平。因此我们使用Forskolin来处理乳头状甲状腺癌细胞株，我们发现Forskolin能够促进PAK4第474位丝氨酸的磷酸化。这些发现提示我们TSH活化PAK4是通过cAMP-PKA信号通路来完成。
　　接下来我们的研究显示TSH能够显著的促进TPC-1和K1细胞的增殖和集落形成，而当沉默PAK4能够抑制TSH对乳头状甲状腺癌增殖和集落形成的促进作用，这一结果提示我们TSH对乳头状甲状腺癌增殖和集落形成的促进作用是通过活化PAK4来行使的。
　　为了进一步证实TSH-PKA-PAK4信号通路在乳头状甲状腺癌中的作用，以及PAK4和PKA之间功能性的联系，我们通过Western blot的方法检测了乳头状甲状腺癌中磷酸化PAK4和PKA催化亚基的表达情况，我们发现PKA催化亚基和PAK4第474位磷酸化呈正相关。我们进一步通过免疫组化的方法证实PKA催化亚基和PAK4第474位磷酸化呈正相关。为了更好的验证他们之间的相关性，我们通过Spearman相关分析发现TSH与PAK4第474位的活化(r=0.502，P＜0.001)以及PKA催化亚基和PAK4第474位的活化(r=0.596;P＜0.001)均呈现正相关。
　　结论：
　　1、PAK4及第474位丝氨酸磷酸化PAK4在乳头状甲状腺癌中高表达，并且与其临床恶性进程呈正相关。
　　2、ROS通过上调PAK4的表达促进乳头状甲状腺癌增殖、迁移和侵袭。
　　3、TSH通过cAMP-PKA通路活化PAK4进而促进乳头状甲状腺癌的增殖。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 PAK4及活化型PAK4在乳头状甲状腺癌中的表达

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 PAK4参与TSH和ROS介导的乳头状甲状腺癌恶性进程

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 Ⅱ类PAK在肿瘤进程中的作用

在学期间科研成绩

致谢

个人简历