IRE1α通路及PDIA6对PTSD大鼠蓝斑神经元内质网应激调控的分子机制

摘要

目的：
　　需肌醇蛋白1(inositol requiring1，IRE1)是一种定位于内质网膜的Ⅰ型跨膜蛋白，也是内质网应激感受器中最保守的一个，具有激酶和核糖核酸内切酶的双重活性。在哺乳动物中，IRE1有两种剪切体-IRE1α和IRE1β，其中IREα广泛分布于各种细胞中，而IRE1β仅在胃肠中表达，两者在功能上没有区别。生理条件下，IRE1会与内质网分子伴侣BiP/GRP78结合，保持未活化状态。
　　PDIA6(Protein disulfide isomerase family A，member6)又被称为P5，属于蛋白质二硫键异构酶(Protein disulfide isomerase，PDI)家族成员，定位于内质网、高尔基复合体上。有研究认为，PDIA6既是一种折叠酶，同时也有分子伴侣的活性。作为折叠酶，PDIA6可催化蛋白二硫键的形成;作为分子伴侣，PDIA6可与底物结合，帮助酶的底物去折叠或折叠，提高酶的效率。已有研究表明，在生理容许范围内，通过与IRE1腔内结构域的特殊胱氨酸相结合，PDIA6对于限制UPR信号很重要，特别是在激活状态。PDIA6可终止IRE1信号。
　　越来越多的证据显示，许多病理条件会持续干扰内质网稳态引发UPR，从而引起疾病的发生，如创伤后应激障碍（Posttraumatic stress disorder，PTSD）。PTSD又称延迟性心因性反应，是由突发性、灾难性事件（如地震、海啸、洪灾等）导致个体延后出现和长期持续存在的一种精神障碍。PTSD是以创伤性事件为主要致病因素，其典型临床表现主要包括:反复发生的闯入性创伤事件再体验及记忆异常，持续逃避回忆及反应麻木，警觉性增高和负性认知的改变等。PTSD在总人口的终生患病率达到约7％，对人们的生活质量造成严重影响，目前对其研究已涉及多个学科领域，如内分泌学、行为学、心理学及神经生物学等。虽然人们对PTSD的发病机制至今仍不清楚，但蓝斑长期以来被认为与PTSD发病有关。
　　本课题组前期研究已证实，PTSD大鼠蓝斑神经元出现细胞凋亡的变化，与PTSD的发病机制有一定关联。在此基础上，本研究拟以内质网跨膜蛋白IRE1α为切入点，并给予大鼠IRE1α特异性抑制剂STF-083010进行干预，探讨IRE1α通路及分子伴侣PDIA6调控PTSD大鼠蓝斑神经元内质网应激的分子机制，为深入研究PTSD发病及预防、治疗提供实验依据。
　　方法：
　　1、应用单一连续应激(Single Prolonged Stress，SPS)法构建大鼠PTSD模型。选取100只Wistar雄性大鼠，随机分为5组:正常对照组和SPS刺激后1d、4d、7d、14d组。
　　2、应用高架十字迷宫(the elevated plus maze，EPM)行为学方法验证PTSD-SPS模型是否制作成功;采用透射电镜技术及原位缺口末端标记法（TUNEL）检测PTSD大鼠蓝斑神经元凋亡变化;采用Western Blot检测正常对照组和模型组大鼠蓝斑CHOP蛋白表达。
　　3、采用免疫荧光、Western Blot及qRT-PCR检测正常对照组和模型组大鼠蓝斑IRE1α蛋白及mRNA表达;采用Western Blot及qRT-PCR检测正常对照组和模型组大鼠蓝斑XBP1 s和BiP/GRP78蛋白及mRNA表达;采用免疫荧光和WesternBlot检测正常对照组和模型组大鼠蓝斑PDIA6蛋白表达。
　　4、另取96只Wistar雄性大鼠，随机分为2组:SPS刺激后1d组和7d组;然后每组再随机分为4组:non-SPS+ vehicle组（即正常对照组），SPS+ vehicle组（SPS刺激后，腹腔注入与抑制剂等体积的DMSO），SPS+ STF组（SPS刺激后，腹腔注入IRE1α抑制剂STF-083010），non-SPS+ STF组(正常大鼠腹腔注入抑制剂STF-083010)。采用Western Blot检测大鼠蓝斑IRE1α、XBP1s、BiP/GRP78和CHOP蛋白表达;应用TUNEL染色技术检测大鼠蓝斑神经元的凋亡改变;应用高架十字迷宫(EPM)评估大鼠的行为学变化。
　　结果：
　　一、大鼠行为学变化
　　高架十字迷宫测试结果显示，与正常对照组比较，SPS刺激后7d，大鼠的开臂滞留时间百分比（开臂滞留时间/总时间）和开臂进入次数百分比（开臂进入次数/总进臂次数）均显著降低。
　　二、大鼠蓝斑神经元凋亡情况
　　（一）透射电镜观察凋亡蓝斑神经元
　　正常对照组大鼠蓝斑神经元核大而圆，染色质分布均匀。SPS刺激后，可见蓝斑中部分神经元核内染色质浓缩、凝结成块，并沿核膜排列、边集;胞质溶解。
　　（二）TUNEL染色结果
　　正常对照组PTSD大鼠蓝斑中TUNEL阳性神经元少见;与正常对照组比，SPS刺激后大鼠蓝斑TUNEL阳性神经元数量明显增加，且细胞凋亡率随时间延长而增加，于SPS刺激后7d达高峰，14d显著降低。
　　（三）Western Blot检测结果
　　SPS刺激后大鼠蓝斑中CHOP蛋白表达较正常对照组明显增加。CHOP表达于SPS刺激后1d开始升高，7d达峰值，14d表达降低。
　　三、大鼠蓝斑中IRE1α的表达变化
　　（一）免疫荧光结果
　　激光共聚焦显微镜扫描结果显示，正常对照组大鼠IRE1α蛋白主要表达于蓝斑神经元胞质中，在SPS刺激后1d，IRE1α表达增加最显著。
　　（二）Western Blot检测结果
　　与正常对照组相比，IRE1α蛋白于SPS刺激后早期其表达即明显增加，随后逐渐下降。IRE1α蛋白表达于SPS刺激后1d达高峰。
　　（三）qRT-PCR检测结果
　　与Western Blot检测结果相一致，SPS刺激后IRE1α的mRNA表达水平较正常对照组显著升高，于刺激后1d达高峰，随后逐渐降低。
　　四、大鼠蓝斑中XBP1s的表达变化
　　（一）Western Blot检测结果
　　与正常对照组相比，XBP1的活性形式XBP1s于SPS刺激后其表达明显增加，7d达高峰，14d显著降低。
　　（二）qRT-PCR检测结果
　　与Western Blot检测结果相一致，SPS刺激后XBP1s的mRNA表达水平较正常对照组显著升高，于刺激后7d达高峰，14d显著下降。
　　五、大鼠蓝斑中BiP/GRP78的表达变化
　　（一）Western Blot检测结果
　　SPS刺激后大鼠蓝斑中BiP/GRP78蛋白表达较正常对照组明显增加。BiP/GRP78表达于SPS刺激后1d开始升高，14d达高峰。
　　（二）qRT-PCR检测结果
　　与Western Blot检测结果相一致，SPS刺激后BiP/GRP78的mRNA表达水平较正常对照组显著升高，于刺激后14d达高峰。
　　六、大鼠蓝斑中PDIA6的表达变化
　　（一）免疫荧光结果
　　与正常对照组比较，SPS刺激后4d，大鼠蓝斑神经元中PDIA6表达明显增强，随后其表达逐渐降低。
　　（二）Western Blot检测结果
　　SPS刺激后大鼠蓝斑PDIA6蛋白表达较正常对照组明显增加，于刺激后4d达高峰，随后逐渐下降，与其免疫荧光结果基本一致。
　　七、STF-083010对大鼠蓝斑中IRE1α通路及细胞凋亡的影响
　　（一）大鼠行为学改变
　　SPS刺激后7d，SPS+STF组中大鼠的开臂滞留时间百分比和开臂进入次数百分比均显著高于SPS+ vehicle组。
　　（二）Western Blot检测结果
　　SPS刺激后1d，SPS+STF组中大鼠蓝斑IRE1α蛋白表达较SPS+ vehicle组明显降低; SPS刺激后7d，SPS+STF组中大鼠蓝斑XBP1s、BiP/GRP78及CHOP蛋白表达较SPS+ vehicle组均显著降低。
　　（三）TUNEL染色结果
　　SPS刺激后7d，SPS+STF组中大鼠蓝斑TUNEL阳性细胞凋亡率较SPS+ vehicle组显著降低。
　　结论：
　　1、PTSD大鼠蓝斑神经元出现细胞凋亡变化，与内质网应激密切相关。
　　2、SPS刺激可诱导与内质网应激相关的IRE1α通路的过度活化，这可能是导致PTSD大鼠蓝斑神经元凋亡的重要机制。
　　3、SPS诱导的IRE1α通路的活化可被特异性抑制剂STF-083010削弱，进一步证实IRE1α通路的过度激活介导了PTSD大鼠蓝斑神经元凋亡。也为PTSD的预防治疗提供实验依据。
　　4、SPS诱导蓝斑神经元内质网应激早期，分子伴侣PDIA6的表达上调可能有利于蓝斑神经元存活，这为寻找治疗PTSD的药物靶点提供了实验依据。

目录

声明

摘要

英文缩略语

论文一 创伤后应激障碍大鼠蓝斑神经元凋亡的实验研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文二 IRE1α通路及内质网分子伴侣PDIA6在创伤后应激障碍大鼠蓝斑中的表达

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

论文三 抑制剂STF-083010对IRE1α通路及蓝斑神经元凋亡的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新的自我评价

参考文献

综述 蓝斑与应激反应关系的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

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