肛门直肠畸形大鼠盆底肌异常发育机制及子宫内移植肌卫星细胞修复作用的研究

摘要

目的：先天性肛门直肠畸形(Anorectal Malformations，ARMs)是小儿外科常见的先天畸形之一，居消化道畸形第一位，在新生儿的发病率为1/5000～1/1500。虽然近年来对肛门直肠畸形的治疗方式有了很大的改善，术后监护也取得了很大水平进步，这使得患者整体预后得到了显著改善，但是通过对ARMs患者长时间的随访发现，很多ARMs患者在手术后仍然存在便秘、便失禁等肛肠功能障碍相关的并发症，对患者的日常生活带来很多不便，对他们的生理、心理健康造成了非常严重的影响。患者术后仍然存在肛肠功能障碍是由多种因素导致的，如盆底肌发育障碍、支配盆底肌的神经分布出现异常、肠神经系统发育不良和骶尾椎发育不良等。其中，盆底横纹肌复合体(Striated Muscle Complex，SMC)是控制排便功能的关键因素之一，所以SMC发育异常是影响ARMs术后患者排便功能最重要的原因之一。正常胚胎在发育过程中出现异常或发育障碍导致了患者发生肛门直肠畸形。引起患者在胚胎期肛门直肠发育障碍的具体原因尚不清楚，目前，很多学者认为肛门直肠畸形的发生很大程度上受到遗传因素的影响。研究已经证实，在肛门直肠畸形患者中，肛门直肠存在畸形的同时多伴随发生不同程度的横纹肌复合体发育异常。虽然为了阐明肛门直肠畸形横纹肌复合体异常发育的机制，人们进行了大量的研究，但是，迄今为止，其胚胎异常发育机制尚不清楚。前期的大量动物实验表明:SMC胚胎发育的时期是E16-E21，与正常组相比，ARMs组的SMC在E16、E17时在形态与走形上没有明显差异，但是从E18开始，SMC开始向头侧、腹侧及中线方向移位，即向直肠盲端下方聚集，并会合于直肠盲袋后下方的中线上，呈现倒“V”字结构。在高倍镜下可见肌纤维走行紊乱，在肌束间可以观察到有大量结缔组织浸润。凋亡在正常SMC的胚胎发育过程中发挥着非常重要的作用，异常凋亡可能是引起肛门直肠畸形大鼠SMC发育异常的原因之一。此外，ARMs大鼠SMC存在肌卫星细胞结构和功能的异常，这也可能导致SMC发育不良。也有研究显示，与同一时间点的正常组相比，Wnt5a在ARMs组SMC表达下调，这种表达的不平衡性表明Wnt5a在肛门直肠畸形胎鼠盆底SMC的异常发育过程中发挥了非常重要的作用。干细胞信号网络调节异常是先天畸形发生的原因之一，而这种调节异常往往是因为表观遗传和基因改变造成的。研究已经证实，Wnt信号通路与其他的分子信号通路在作用上有相互交叉，包括Shh，BMP/TGF-β，Fgf和Notch，这些共同构成了干细胞信号网络。BMPs是TGF-β超家族的亚群，在肌卫星细胞的激活和增殖过程中发挥着至关重要的作用，并且能够阻止过早的肌源性分化。BMPs通过与细胞表面受体结合从而启动信号转导级联，而且形成由两个二聚体（Ⅰ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体和Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体）组成的异四聚体复合物。此外，研究发现，刺激BMP信号通路可导致处于激活状态的卫星细胞数量增加，以及处于分化状态的成肌细胞数量减少。而且，研究表明，BMP4、BMP7在胚胎后肠的发育过程中发挥了重要作用，BMP4、BMP7在后肠的表达下调，可能导致了ARMs后肠的异常发育。然而，BMP4、BMP7在ARMs异常发育的SMC中的作用尚不清楚。当前针对肛门直肠畸形术后患儿仍然存在肛肠功能障碍的问题，提出了许多治疗措施来加强盆底肌的功能，以期得到更好的排便控制，诸如生物反馈训练、电刺激括约肌与骶神经以及内外括约肌成形术等的这些措施主要通过重新建立神经反射弧以及改变直肠肛管角度等方面以使患者得到更好的排便控制，尽管这些措施从一定程度上改善了ARMs术后患者的肛肠功能障碍的症状，但是随访发现这些措施的远期效果并不是十分理想，因为这些措施并没有从根本上解决控制排便的盆底横纹肌复合体存在异常发育的问题。目前，针对ARMs患者存在的发育不良的SMC这一问题，临床上通常将股薄肌、臀大肌等肌肉移植到发育不良的SMC区域来部分代偿SMC的功能，但是因为控制排便的盆底肌的肌纤维是耐疲劳的Ⅰ型肌纤维，而这些肌肉的肌纤维是易疲劳的Ⅱ型肌纤维，而且支配这些肌肉与盆底肌肌纤维的神经分布不同，排便反射的反射弧无法正常建立，难以达到理想的远期效果。细胞移植作为修复损伤和改善预后的一种新的治疗思路，现在越来越受到人们的普遍关注。肌卫星细胞在正常情况下处于静止状态，定植于骨骼肌纤维基底膜下，当骨骼肌组织受到病理刺激或者损伤后，位于基底膜下的卫星细胞迅速活化，增殖以及融合，从而便于处于病理状态的肌纤维发生迅速修复和再生。本文应用乙烯硫脲(ethylenethiourea，ETU)对Wistar大鼠进行致畸，建立肛门直肠畸形动物模型，探索正常胎鼠及ARMs胎鼠在盆底SMC胚胎发育过程中差异表达的基因，以及BMP4、BMP7时空表达存在的差异，同时通过提取骨骼肌卫星细胞经过体外培养增殖，携带绿色荧光蛋白的腺病毒转染后移植入ARMs胎鼠发育异常的SMC区域，并在移植后观察肌卫星细胞在体内存活、分化情况，探索肌卫星细胞移植治疗ARMs发育不良SMC的可行性。
　　方法：⑴动物模型制各及标本收集。Wistar大鼠，体重250～300 g，10～12周龄，由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供，雌雄鼠以5∶1比例交配，次日清晨阴道涂片，置于显微镜下观察，发现载玻片上有精子者则定为孕0天(E0)，于E10经胃管注入1％ ETU(125 mg/kg)致畸，制作ARMs大鼠动物模型，对照组给予等量的生理盐水。选择E17、E19、E21三个时间点，用10％水合氯醛（3.2 ml/kg）腹腔注射麻醉孕鼠，然后剖宫取胎，一部分标本取其盆底部放于4％多聚甲醛溶液中进行固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常温保存，用于切片进行免疫组化染色;另一部分标本在解剖显微镜下取盆底SMC组织，深度冰箱冻存，用于Western Blotting及qRT-PCR实验。⑵应用Agilent全基因表达谱芯片对差异表达基因进行筛查。在E17、E21取正常组及ARMs组SMC组织，进行“Agilent全基因表达谱芯片”实验（上海伯豪生物技术有限公司提供）。筛查正常组和ARMs组中可能存在的差异表达的基因，以及参与其中的信号通路;并运用qRT-PCR对其中与后肠发育和骨骼肌发育相关的基因进行验证。⑶BMP4及BMP7在两组大鼠胚胎SMC发育过程中表达的研究。应用免疫组化方法观察BMP4及BMP7蛋白在大鼠胚胎晚期SMC发育过程中的时空表达模式;应用Western Blotting的方法对BMP4及BMP7蛋白进行定量分析;运用qRT-PCR技术对在正常组和ARMs组大鼠胚胎发育过程中盆底肌中BMP4及BMP7的mRNA表达水平进行定量分析，初步探索两种基因在SMC发育过程中可能起到的作用。⑷子宫内肌卫星细胞移植修复盆底横纹肌复合体。应用两步消化法从出生3天内新生雄鼠后肢提取肌卫星细胞，并利用差速贴壁法进行纯化，然后进行体外培养增殖，应用免疫荧光染色法对肌卫星细胞进行鉴定，肌卫星细胞经携带绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-eGFP)转染后，移植入ARMs胎鼠的SMC区域，观察移植后肌卫星细胞在ARMs胎鼠体内SMC区域存活及分化情况，初步探索子宫内移植肌卫星细胞治疗ARMs胎鼠发育不良的SMC的可行性。⑸统计分析。所有的实验数据均以均值±标准差来表示，应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，各胎龄正常组与ARMs组差异的比较采用t检验，移植后胎鼠存活率的比较采用卡方检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　结果：①全基因表达谱芯片筛查(筛查条件为:Fold Change cut-off:2.0，P-value cut-off:0.05)结果显示:ARMs组较Normal组E17下调基因296个，上调基因180个，E21下调基因250个，上调基因230个。运用qRT-PCR技术对其中与后肠发育和骨骼肌发育相关的差异基因进行验证，结果显示qRT-PCR的结果与表达谱芯片的结果趋势基本一致。②对BMP4蛋白及mRNA的定性及定量研究发现，ARMs胎鼠SMC中BMP4表达明显减弱。正常组中，从E17到E21，随着胚胎的发育，BMP4表达逐渐增强。而在ARMs组中，同一时间点BMP4的表达明显较正常组减弱，并且随时间推移这种差异表达越明显。③通过对比研究BMP7蛋白及mRNA在两组胚胎SMC组织中的时空表达，发现在正常组中，BMP7蛋白在E17时在SMC中有表达，在E19时BMP7表达强度明显升高，在SMC及球海绵体肌中均可以看到BMP7标记的阳性细胞，在E21时BMP7表达降低，表达位置没有变化。而在ARMs组，与正常组同时间点相比，BMP7表达明显减弱，但是表达趋势与正常组一致。④提取的肌卫星细胞在体外培养后48h后Desmin染色阳性，体外培养72h后Myosin染色阳性。肌卫星细胞经Ad-eGFP转染后移植到ARMs胎鼠SMC区域，移植后肌卫星细胞在ARMs胎鼠体内存活，并表达骨骼肌细胞骨架蛋白Desmin以及成熟骨骼肌细胞特异性标记Myosin。
　　结论：⑴大鼠盆底横纹肌复合体的胚胎期发育是一个非常复杂的过程。全基因表达谱芯片筛查结果提示正常组和ARMs组中差异表达的基因较多，并且有较多信号传导通路参与，这些差异表达的基因及所在的信号传导通路可能是导致ARMs胎鼠SMC异常发育的原因。⑵E17-E21，BMP4和BMP7在ARMs组SMC中的表达较正常组弱，BMP4和BMP7的低表达可能与ARMs盆底横纹肌复合体异常发育有关。⑶肌卫星细胞在体外培养后能分化为成肌细胞和多核肌管，肌卫星细胞经转染后移植至ARMs胎鼠盆底SMC区域后，能分化成为成熟的骨骼肌细胞，说明子宫内肌卫星细胞移植能够修复ARMs胎鼠发育不良的盆底SMC。

目录

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摘要

英文缩略语

第一部分：正常与肛门直肠畸形大鼠盆底横纹肌复合体差异表达基因的研究

1 前言

2．1 主要试剂和仪器

2．2 实验方法

3 结果

3．1 大体观察结果

3．2 全基因表达谱芯片筛查差异表达基因

3．3 qRT-PCR验证表达谱芯片筛查结果

4 讨论

第二部分：BMP4及BMP7在正常与肛门直肠畸形大鼠盆底横纹肌复合体发育中表达对比研究

5 前言

6．1 主要试剂和仪器

6．2 实验方法

7．1 大体观察结果

7．2 BMP4及BMP7蛋白在大鼠胚胎盆底SMC的表达情况

7．3 Western Blotting检测SMC中BMP4和BMP7蛋白定量表达

7．4 qRT-PCR检测BMP4和BMP7在SMC中mRNA的表达

8 讨论

第三部分：子宫内肌卫星细胞移植修复发育不良的横纹肌复合体的实验研究

9 前言

10 材料与方法

10．1 主要试剂和仪器

10．2 实验方法

11 结果

11．1 肌卫星细胞的体外培养、鉴定及转染

11．2 移植肌卫星细胞在ARMs胎鼠盆底肌区域的存活情况

11．3 移植的肌卫星细胞在ARMs胎鼠SMC区域的分化情况

12 讨论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 肛门直肠畸形胎鼠盆底肌发育异常的分子机制及产前修复盆底肌的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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