阿托伐他汀钙在PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化中的作用及其机制研究

摘要

目的:血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)的异常增殖及迁移是动脉粥样硬化、血管损伤如血管成形术、支架置入术、心脏搭桥术后的血管再狭窄、高血压、糖尿病血管病变等心血管疾病的共同病理特征，而表型转化是VSMCs的病理性增殖的基础。因此，改善VSMCs的异常增殖、迁移和表型转化，对防治动脉粥样硬化和支架置入术后血管再狭窄等心血管病有重大意义。VSMCs的表型转化即收缩型与合成型之间的相互转变。在成熟的血管中，VSMCs呈现收缩表型（分化型），主要特征是表达一系列收缩型标志蛋白，具有较低的增殖和迁移率，以及分泌较少的细胞外基质蛋白。血小板源性生长因子-BB(Platelet derivedgrowth factor-BB，PDGF-BB)是一种强有效的促有丝分裂剂，能够诱导VSMCs由收缩型向合成型转化。他汀类药物，即3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，在临床中主要用于降低血脂。近年来，已有文献报道了他汀类药物独立于降脂的其他心血管保护作用，如抗炎、抗动脉粥样硬化、抗氧化应激、抗血栓形成、升高血浆脂联素水平、保护受损的血管内皮等诸多方面的作用。阿托伐他汀钙（立普妥）是临床上非常常用的降脂药物之一，可以降低心肌梗死、脑卒中、血管重建术、心绞痛等疾病的患病风险。然而，阿托伐他汀钙是否发挥了除降脂外的其他有利于心血管疾病的作用的报道尚不多见。而且，阿托伐他汀钙是否能够通过引起VSMCs的表型转化从而发挥其在抗动脉粥样硬化等心血管疾病中的作用尚不明确。因此，本研究旨在探讨阿托伐他汀钙在PDGF-BB诱导的VSMCs增殖、迁移及表型转化中的作用，并探讨这一过程中可能的信号转导机制。
　　研究方法:1、提取、分离与鉴定原代大鼠胸主动脉VSMCs，并进行传代培养，实验均采用4-7代大鼠VSMCs。2、待VSMCs长到70％-80％融合度后，撤血清饥饿24小时，再进行干预。3、给予20ng/ml PDGF-BB，不同浓度(1-50uM)的阿托伐他汀钙处理VSMCs，进行细胞增殖相关实验，10uM阿托伐他汀钙处理VSMCs进行细胞迁移，细胞周期，细胞骨架，目的基因的表达等实验。4、采用24孔板培养细胞，利用细胞计数板计数活细胞数量。5、噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率。6、EdU染色法观察细胞内DNA合成情况。7、采用流式细胞术PI(PropidiumIodide，碘化丙啶)单染法检测细胞周期变化。8、采用划痕定点修复实验，transwell转移小室、RTCA(Real Time Cellular Analysis)实时无标记细胞分析技术检测VSMCs迁移能力。9、采用鬼笔环肽染色法，荧光显微镜下观察细胞骨架及形态变化，并计算细胞面积及圆度。10、采用Western blot技术检测VSMCs收缩型标志蛋白αSMA(Smooth muscleα-actin)，SM22α和calponin的表达水平;检测磷酸化Akt(p-Akt)，总Akt(total Akt), p-PDGFRB(PDGF-receptorbeta), total PDGFRB, p-PLCγ1, totalPLCγ1(phospholiase C-gamma1)，p-ERK1/2，total ERK1/2的表达水平;检测细胞周期相关蛋白PCNA，CDK2，CDK4，cyclinD1，cyclinE，及细胞迁移和粘附相关蛋白MMP2，MMP9，ICAM-1和VCAM-1的表达水平。11、采用细胞免疫荧光技术，荧光显微镜下观察αSMA、p-PDGFBR、p-Akt的表达水平及分布情况。
　　使用SPSS19.0版专业统计软件进行数据分析，计量资料两组和多组间比较分别采用配对t检验和单因素方差分析，以P＜0.05为有统计学差异，每个实验至少重复三次。利用Image J1.47软件进行荧光定量分析、细胞计数分析、条带灰度值分析等。采用GraphPad Prism5、Adobe Photoshop CS6等软件绘制柱状图、曲线图等。
　　结果:1、阿托伐他汀钙抑制PDGF-BB诱导的VSMCs的增殖，且呈现剂量和时间依赖的趋势（P＜0.05）。20ng/mlPDGF-BB能够极大地促进VSMCs的增殖(P＜0.05)，给予不同浓度的阿托伐他汀钙干预，5μM，10μM，20μM，50μM的阿托伐他汀钙明显抑制了PDGF-BB诱导的VSMCs的增殖（P＜0.05），且呈现剂量依赖的趋势，而1μM和2μM的阿托伐他汀钙干预PDGF-BB诱导的VSMCs，与单独PDGF-BB组相比，其增殖率的改变没有统计学意义。给予10μM的阿托伐他汀钙刺激PDGF-BB诱导的VSMCs6h，12h，24h，48h，结果发现，阿托伐他汀钙抑制PDGF-BB诱导的VSMCs的增殖呈时间依赖的趋势（P＜0.05）。2、阿托伐他汀钙抑制VSMCs周期进程，阻断细胞进入S期，使VSMCs停滞在G0/G1期（P＜0.05）。20ng/mlPDGF-BB刺激VSMCs24h后，与对照组相比，明显降低了G0/G1期细胞比例，升高了S期和G2/M期细胞比例(P＜0.05)，而10μM阿托伐他汀钙与PDGF-BB共同刺激VSMCs组与单独PDGF-BB组相比，可以降低S期的细胞比例，抑制细胞周期进程(P＜0.05)。3、阿托伐他汀钙能够降低VSMCs增殖细胞核抗原PCNA(proliferating cell nuclear antigen)，G0/G1期相关蛋白CDK(cyclin-dependent kinase)2，CDK4，cyclinD1，cyclinE的表达水平（P＜0.05）。与对照组相比，20ng/ml PDGF-BB能够升高VSMCs内PCNA，CDK2，CDK4，cyclinD1，cyclinE的表达水平（P＜0.05），而10μM阿托伐他汀钙与PDGF-BB共同作用VSMCs，与PDGF-BB组相比，可以降低PCNA，CDK2，CDK4，cyclinD1，cyclinE的表达水平（P＜0.05）。4、阿托伐他汀钙抑制PDGF-BB诱导的VSMCs的迁移能力（P＜0.05）。划痕定点修复实验， transwell转移小室实验，和RTCA实时无标记细胞分析实验结果显示，与对照组相比，20ng/ml PDGF-BB处理VSMCs24h，能够增加VSMCs的迁移能力（P＜0.05），而同时给予10μM阿托伐他汀钙共同刺激VSMCs后，与PDGF-BB组相比，阿托伐他汀钙能够降低VSMCs的迁移能力（P＜0.05）。5、Western Blot结果显示，阿托伐他汀钙能够降低PDGF-BB诱导的VSMCs中迁移和粘附相关蛋白基质金属蛋白酶MMP(Matrix metalloproteinase)2，MMP9，细胞间粘附分子ICAM-1(intercellularadhesion molecule1)和血管细胞粘附分子VCAM-1(vascular cell adhesion molecule1)的表达（P＜0.05）。6、利用鬼比环肽对细胞骨架进行染色，荧光显微镜下观察并拍照，结果发现，PDGF-BB能够使VSMCs细胞面积变大，形态变圆，骨架重排，肌丝分布杂乱，阿托伐他汀钙预处理能够抑制PDGF-BB诱导的VSMCs骨架、形态、大小的改变（P＜0.05）。7、Western Blot结果显示，PDGF-BB处理VSMCs后，VSMCs收缩型标志蛋白αSMA，SM22α和calponin的表达水平下降，阿托伐他汀钙预处理能够使PDGF-BB诱导的VSMCs收缩型标志蛋白的表达水平增强（P＜0.05）。8、Western Blot结果显示，PDGF-BB能够增强VSMCs中Akt，PDGFRB，PLCγ1，ERK1/2的磷酸化水平(P＜0.05)，且使得Akt磷酸化水平在30min达到最高峰，并在120min时仍维持较高水平。阿托伐他汀钙预处理能够削弱PDGF-BB诱导的VSMCs中PDGFRB和Akt通路的激活(P＜0.05)，而对PLCγ1，ERK1/2的磷酸化水平无明显影响。9、PDGFRB是PDGF-BB作用于VSMCs引起磷脂酰肌醇3激酶PI3k(phosphatidylinositol-3-kinase)/Akt信号通路激活的上游信号分子，相比于单独PDGF-BB处理的VSMCs，阿托伐他汀钙预处理能够使得PDGF-BB诱导的VSMCs内p-Akt的表达下降，其分布由胞膜向胞质及胞核发生移位，p-PDGFRB的表达下降，其分布由核周向核内及胞质移位。10、给予PI3k/Akt通路抑制剂LY294002预处理VSMCs，能够抑制PDGF-BB诱导的VSMCs的增殖(P＜0.05)，LY294002与阿托伐他汀钙联合作用，细胞增殖能力进一步下降。11、LY294002能够抑制PDGF-BB诱导的VSMCs的周期进程并降低PCNA的表达（P＜0.05），LY294002与阿托伐他汀钙联合作用，进入S期的细胞比例及PCNA的表达进一步下降(P＜0.05)。12、LY294002使PDGF-BB诱导的VSMCs的迁移能力下降（P＜0.05），LY294002与阿托伐他汀钙联合作用可以协同降低VSMCs的迁移能力（P＜0.05）。13、LY294002与阿托伐他汀钙联合作用可以协同增强VSMCs收缩型标志蛋白αSMA，SM22α和calponin的表达水平（P＜0.05）。
　　结论:1、阿托伐他汀钙能够抑制PDGF-BB诱导的VSMCs的增殖和迁移。2、阿托伐他汀钙通过阻断细胞周期进程，抑制相关周期蛋白PCNA，CDK2，CDK4，cyclinD1，cyclinE的表达，使细胞发生G0/G1期阻滞，从而发挥其抑制PDGF-BB诱导的VSMCs的增殖的作用。3、阿托伐他汀钙通过抑制迁移相关蛋白MMP2，MMP9，VCAM-1，和ICAM-1的表达，使PDGF-BB诱导的VSMCs的迁移能力下降。4、阿托伐他汀钙能够抑制PDGF-BB诱导的VSMCs的表型转化，表现为使VSMCs收缩型标志蛋白αSMA, SM22α和calponin的表达水平增高。5、阿托伐他汀钙通过抑制PDGFRB/PI3K/Akt信号通路的激活，从而发挥其抑制VSMCs病理性增殖，迁移和表型转化的作用。

目录

声明

摘要

英文缩略语表

第一部分：阿托伐他汀钙对PDGF-BB诱导的VSMCs增殖，迁移和表型转化的影响

1 前言

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 实验结果

3．1 原代大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)的鉴定

3．2 阿托伐他汀钙抑制PDGF-BB诱导的VSMCs增殖

3．3 阿托伐他汀钙抑制PDGF-BB诱导的VSMCs细胞周期进程并降低相关周期蛋白的表达

3．4 阿托伐他汀钙抑制PDGF-BB诱导的VSMCs迁移

3．5 阿托伐他汀钙降低PDGF-BB诱导的VSMCs内迁移相关蛋白的表达

3．6 阿托伐他汀钙抑制PDGF-BB诱导的VSMCs的形态、面积变化，肌丝分布和骨架重排

3．7 阿托伐他汀钙对PDGF-BB诱导的VSMCs内收缩型标志蛋白的表达和定位的影响

4 讨论

5 结论

第二部分：PDGFRB／PI3k／Akt信号通路在阿托伐他汀钙抑制PDGF-BB诱导的VSMCs表型转化中的作用

6 前言

7．1 实验材料

7．2 实验方法

8 实验结果

8．1 阿托伐他汀钙抑制PDGF-BB诱导的VSMCs内PDGFRB和PI3k／Akt信号通路的激活

8．2 PDGFRB信号通路能够调节PDGF-BB诱导的VSMCs内PI3K／AKT信号的活化，阿托伐他汀钙影响PDGF-BB诱导的p-AKT和p-PDGFRB在细胞内的分布

8．3 PI3k／Akt通路抑制剂LY294002与阿托伐他汀钙在抑制PDGF-BB诱导的VSMCs的增殖方面具有协同作用

8．4 PI3k／Akt通路抑制剂LY294002与阿托伐他汀钙协同抑制PDGF-BB诱导的VSMCs的周期进程，使其发生G0／G1期阻滞，并进一步降低PCNA的表达

8．5 LY294002与阿托伐他汀钙联合作用可以协同降低VSMCs的迁移能力

8．6 LY294002与阿托伐他汀钙联合作用可以协同抑制PDGF-BB诱导的VSMCs收缩性标志蛋白表达的下降

9 讨论

10 结论

11 全文结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 血管平滑肌细胞(VSMCs)表型转化与心血管疾病

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历