丙泊酚反复暴露对发育期大鼠学习记忆影响及机制的研究

摘要

目的:丙泊酚是临床较常用的静脉麻醉药，广泛应用于国内外临床麻醉诱导及维持，ICU镇静和门诊各种影像学检查。因其具有起效快速、苏醒迅速、用后恶心呕吐、躁狂谵妄等副作用较小等优点，也被广泛应由于新生儿和婴幼儿的全身麻醉中。尽管其被广泛使用，丙泊酚对于儿童的安全性及副作用的矛盾报道几乎与其他全麻药物一样，均无全面详尽的结论。有报道称丙泊酚可激活GABA受体，从而启动细胞凋亡的级联反应。因为GABA介导的神经元活性是哺乳动物的脑发育的必需因素，因此丙泊酚麻醉很可能干预未成熟神经系统，从而产生学习记忆等功能障碍。MiRNA一类能时序调控发育进程，长度约为20～24个核苷酸的内源性非编码蛋白的小分子RNA，其通过与靶基因mRNA互补配对来降解或抑制mRNA转录，从而调控靶基因表达。在神经系统中，miRNA的表达具有高度的保守性、组织特异性和时序性，是神经发育过程中重要的调控因子。随着对miRNA研究的深入，人们将研究视角逐渐转移到其与全麻药物的关系。已有实验表明，miR-132在培育的海马神经元中存在较多，并且发挥着重要作用包括促进神经元生长，增强树突棘长度等等。因此，本课题通过探讨丙泊酚麻醉对神经发育期大鼠的海马神经毒性、学习记忆能力和与miR-132的变化，进一步提供丙泊酚麻醉对大鼠海马影响的具体分子机制。
　　材料方法:实验动物选用体重13±3 g的7日龄的SD大鼠378只，清洁级，雌雄不拘。将大鼠随机分为两组(n=189只):脂肪乳组(Control组，C组)和丙泊酚组(Propofol组，P组)。P组7日龄腹腔注射丙泊酚40 mg/kg，此时记为0min，再于第120min和第240min注射等量丙泊酚，连续3次;C组等时等量腹腔注入脂肪乳注射液（C组）。于末次注射后，各组立即随机抽取5只，用动脉血气针从左心室采动脉血0.5 ml，进行血气分析。待其余大鼠自然苏醒后，放回原笼。于21日龄断母乳饲养。记末次腹腔注射(240 min)为0h。各组大鼠喂养至28日龄及60日龄时进行学习记忆功能测试，即Morris水迷宫实验。末次造模待大鼠翻正反射恢复时、28 d及60 d水迷宫实验结束时，两组大鼠水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射，取全脑制备石蜡切片，进行Nissl染色分析、caspase-3免疫组化分析和分别利用MAP2和Spinophilin的双重荧光染色分析大鼠海马树突棘变化情况。分别于末次注射后0h，4h，8h，16h，24 h，48 h及出生后第14d，28 d及60 d，大鼠水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射，麻醉后断头取海马组织。利用real-time qRT PCR方法，监测各时间点 miR-132和p250GAP mRNA变化情况;利用western blot探讨miR-132对其靶基因p250GAP，及其下游肌动蛋白Cdc42、Rac1和RhoA的调控作用;利用Western Blot蛋白检测分析大鼠海马树突棘变化情况。同时，实验大鼠（P组和C组）喂养至21d，称重后，给予0.35g/kg水合氯醛腹腔注射暴露大鼠，待暴露成功后，参照大鼠脑图谱，立体定位海马位置，用微量注射器在穿刺点缓慢注入5μ l Ad-miR-132腺病毒载体或Ad-vector空病毒载体(n=24只)。各组大鼠喂养至28日龄及60日龄时进行学习记忆功能测试，即Morris水迷宫实验;分别于微注射后第23d、28 d及60 d，水合氯醛麻醉后断头取海马组织;于第28 d及60 d水迷宫实验结束时，两组大鼠水合氯醛0.35 g/kg腹腔注射麻醉后，取全脑制备石蜡切片。利用real-time qRT PCR方法，监测各时间点miR-132和p250GAP mRNA变化情况;利用western blot探讨miR-132对其靶基因p250GAP，及其下游肌动蛋白Cdc42、Rac1和RhoA的调控作用;利用MAP2和Spinophilin的双重荧光染色和Western Blot蛋白检测分析大鼠海马树突棘变化情况;进行Nissl染色分析、caspase-3免疫组化分析。
　　结果:1.丙泊酚暴露对大鼠空间学习记忆能力的影响:在出生后第28 d进行的定位航行试验第2d至5d，每天P组大鼠的逃逸潜伏期明显多于C组(*p＜0.05)。而在生后第60 d定位航行实验中，第1至5d，每天P组大鼠的逃逸潜伏期明显多于C组(*p＜0.05)。在第60 d进行的空间探索实验中，与C相比，第28及第60日龄P组大鼠，均呈现出明显的平台象限所在时间缩短(*p＜0.05)。2.丙泊酚暴露后对大鼠海马CA1区神经元形态的影响:在第28 d和第60 d水迷宫实验后，P组（P组）神经元所占百分比明显低于各时间段C组（C组）(*p＜0.05)。而在P组中，与第28 d水迷宫实验后大鼠海马CA1区神经元所占比率相比，第60 d水迷宫实验后大鼠神经元明显降低(＃p＜0.05)。3.丙泊酚暴露后对大鼠海马CA1区神经元内caspase-3蛋白表达的影响:P组在第28 d及第60 d水迷宫实验结束后，其海马CA1区神经元内caspase-3蛋白表达明显增强(*p＜0.05)。对于P组，第60 d水迷宫实验结束后的大鼠海马CA1区神经元内caspase-3蛋白表达明显强于其在第28 d水迷宫实验后（＃p＜0.05）。4.Real-time qRT PCR检测丙泊酚暴露后大鼠海马组织中各时间点miR-132的变化:从大鼠出生后第1d起至第60 d，大鼠海马区miR-132含量整体呈递增趋势，并且在第7d至第14d增长迅速，此外，从第14d起，海马区miR-132含量基本维持较高水平且不再增长。与第1d相比，第10、14、21、28、35和第60 d大鼠海马区miR-132含量明显增多，差异有统计学意义(*p＜0.05)。5.Real-timeqRT PCR检测大鼠海马组织中各时间点miR-132的变化:在C组中，与“0h”（第7d)相比，第14d、28 d和60 d时，海马区miR-132的水平明显增多，差异有统计学意义(*p＜0.05)。对于P组，在各个时间点与各自的C组相比，miR-132水平在第4h，8h，48 h和第14d，28 d，60 d有明显的下降，而在第16h和第24 h呈现出明显的增多（＃*＜0.05）。在P组中，与第0h相比，大鼠海马miR-132水平呈现明显的波动变化(**p＜0.05)，即第4h，8h，48 h和第14d，28 d，60 d有明显的下降，而在第16h和第24 h呈现出明显的增多。6.Real-time qRT PCR检测丙泊酚暴露后大鼠海马组织中各时间点p250GAP mRNA表达的变化:在C组中，与“0h”(第7d)相比，第14d、28 d和60 d时，海马区p250GAP mRNA的水平明显下降(*p＜0.05)。在P组中，与第0h相比，海马区p250GAP mRNA的表达水平自第48 h后呈明显增加的趋势（＃p＜0.05）。对于P组，在各个时间点与各自的C组相比，海马区p250GAPmRNA的表达水平在自第24 h起有所增加(**p＜0.05)。7.Western Blot检测丙泊酚暴露后大鼠海马组织中各时间点p250GAP，Cdc42，Rac1和RhoA蛋白的表达情况:在C组中，与“0h”相比，我们发现大鼠海马区p250GAP蛋白在第28 d呈现明显的表达下调(*p＜0.05)，在第28 d的Cdc42和Rac1蛋白表达却呈现出明显的表达增多(*p＜0.05)。在P组，与“0h”相比，我们发现大鼠海马区p250GAP和RhoA蛋白在第28 d呈现明显的表达上调(*p＜0.05)，而在第28 d的Cdc42和Rac1蛋白表达却呈现出明显的下降(*p＜0.05)。8.丙泊酚暴露引起大鼠海马CA1区树突棘的改变:Spinophilin在C组中表达强而多，而在P组中表达均明显减弱(*p＜0.05)。与第28 dP组相比，第60dP组spinophilin表达进一步降低（＃p＜0.05）;Western Blot结果发现，丙泊酚暴露后大鼠海马组织内MAP2和spinophilin蛋白明显的减低(*p＜0.05)。在P组内，与第28 d相比，第60 d大鼠海马组织内MAP2和spinophilin蛋白表达进一步降低（＃p＜0.05）。9.Real-time qRT PCR验证各组大鼠海马内微注射效果:与C组相比，P组和P+ Ad-vector组，大鼠海马内miR-132表达降低(*p＜0.05);脂肪乳+miR-132过表达组(C+Ad-miR-132组)海马内miR-132表达增加(*p＜0.05)，说明过表达效果存在。与P组相比，丙泊酚+ miR-132过表达组(P+ Ad-miR-132组)海马内miR-132表达增多(＃p＜0.05）。10.Real-time qRT PCR检测各组大鼠海马微注射后其miR-132变化情况:与第28d C组相比，P组和P+ Ad-vector组，第28d和第60d大鼠海马内miR-132表达均减低(*p＜0.05)。与第28d P组相比，第28d和第60dP+Ad-miR-132组海马内miR-132表达增多（＃p＜0.05）。11.Real-time qRT PCR检测各组大鼠海马微注射后其p250GAP mRNA变化情况:与C组相比，P组和P+ Ad-vector组，第28d和第60d大鼠海马内p250GAP mRNA表达均增加(p＜0.05)。与第28d P组相比，第28d和第60d P+Ad-miR-132组海马内p250GAP mRNA表达降低（＃p＜0.05）。12.Western Blot检测海马内微注射后各组大鼠海马内p250GAP，Cdc42，Rac1和RhoA蛋白的表达情况:与第28d C组相比，在P组和P+ Ad-vector组中，第28d和第60d大鼠海马内p250GAP和RhoA蛋白表达量均增加(*p＜0.05);而第28d和第60d大鼠海马内Cdc42和Rac1蛋白表达量均降低(*p＜0.05)。13.海马内微注射及丙泊酚暴露对大鼠海马CA1区树突棘的影响:在第28 d时，与C组相比，P组和P+Ad-vector组中表达均明显减弱(*p＜0.05);在第60 d时，与C组相比，P组和P+Ad-vector组中表达仍明显减弱(＃p＜0.05);Western Blot结果也发现，丙泊酚暴露大鼠后导致了其在第28 d和第60 d与C组相比，海马组织内MAP2和spinophilin蛋白明显的减低(*p＜0.05，＃p＜0.05)，P+ Ad-vector组表达也明显减低(*p＜0.05，＃p＜0.05)。然而在P+Ad-miR-132组中，与第28dP组相比，MAP2和spinophilin在大鼠海马区的蛋白含量均明显增强(**p＜0.05);同样，第60 d时与P组相比，其表达也明显加强（＃＃p＜0.05）。14.海马内微注射及丙泊酚暴露对大鼠空间学习记忆能力的影响:在出生后第28 d进行的定位航行试验第2d至5d，每天P组和P+ Ad-vector组大鼠的逃逸潜伏期明显长于C组(*p＜0.05;＃p＜0.05)。而第28d P+ Ad-miR-132组大鼠的逃逸潜伏期与P组相比，明显改善(**p＜0.05)。在生后第60 d定位航行实验第1至5d，每天P组和P+ Ad-vector组大鼠的逃逸潜伏期均明显多于C组(*p＜0.05;＃p＜0.05);而P+Ad-miR-132组大鼠的逃逸潜伏期与P组相比明显缩短(**p＜0.05)。在第6d进行的空间探索实验中，与C组相比，第28及第60日龄P组和P+ Ad-vector组大鼠，均呈现出明显的平台象限所在时间缩短(*p＜0.05)。而P+Ad-miR-132组大鼠的平台象限所在时间与P组相比明显延长（＃p＜0.05）。15.海马内微注射及丙泊酚暴露后对大鼠海马CA1区神经元形态的影响:与28d C组相比，第28d P组、P+Ad-vector组和P+Ad-miR-132组，其海马CA1区神经元的比率明显降低(*p＜0.05);在第60d时，与C组相比，P组、P+ Ad-vector组和P+Ad-miR-132组海马CA1区神经元的比率明显下降（＃p＜0.05）。16.海马内微注射及丙泊酚暴露后对大鼠海马CA1区神经元内caspase-3蛋白表达的影响:与28d C组相比，第28d P组、P+Ad-vector组和P+Ad-miR-132组，其海马CA1区神经元内caspase-3蛋白表达明显增强(*p＜0.05)。在第60d时，与C组相比，P组、P+ Ad-vector组和P+Ad-miR-132组大鼠海马CA1区神经元内caspase-3蛋白表达明显增多（＃p＜0.05）。
　　结论:1.新生7日龄大鼠连续接受3次40mg/kg腹腔注射丙泊酚后其近远期空间学习记忆能力有所改变，具体体现在:空间学习的过程呈现出减慢的趋势及一定的记忆能力的损害。2、新生大鼠接受丙泊酚暴露后可导致其海马神经元树突棘数目的改变，主要通过降低海马miR-132含量，进而增强靶基因p250GAP的水解能力，从而减少肌动蛋白含量（以Cdc42和Rac1为主）来实现的。3、MiR-132在丙泊酚引起的神经发育期大鼠海马神经元损伤过程中发挥了重要的正向调控作用，具体表现为:过表达的海马miR-132可以通过抑制p250GAP的生成，改善丙泊酚引起的肌动蛋白的表达降低，从而使其大量激活（以Rac1和Cdc42为主），以及增加树突棘数量和学习记忆能力。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分 丙泊酚反复暴露对发育期大鼠海马学习记忆影响的研究

1 前言

2．1 材料

2．2 实验方法

3 结果

3．1 大鼠腹腔注射时情况及血气分析结果

3．2 丙泊酚反复暴露对大鼠空间学习记忆能力的影响

3．3 丙泊酚反复暴露对大鼠海马CA1区神经元形态的影响

3．4 丙泊酚反复暴露对大鼠海马CA1区神经元内caspase-3表达的影响

4 讨论

第二部分 丙泊酚反复暴露对发育期大鼠海马miR-132及其下游蛋白的影响的研究

5 前言

6．1 材料

6．2 实验方法

7 结果

7．1 Real-time qRT PCR检测丙泊酚反复暴露致大鼠海马组织中miR-132的变化

7．2 Real-time qRT PCR检测丙泊酚暴露致大鼠海马组织p250GAP mRNA表达的变化

7．3 Western Blot检测丙泊酚暴露致大鼠海马组织p250GAP，Cdc42，Rac1和RhoA蛋白表达的变化

7．4 丙泊酚反复暴露致大鼠海马CA1区树突棘的改变

8 讨论

第三部分 过表达miR-132对丙泊酚反复暴露的神经发育期大鼠的影响的研究

9 前言

10 材料方法

10．1 材料

10．2 实验方法

11 结果

11．2 Real-time qRT PCR检测各组大鼠海马微注射后其miR-132变化情况

11．4 Western Blot检测海马内微注射后各组大鼠海马内p250GAP，Cdc42，Rac1和RhoA蛋白表达的变化

11．5 海马内微注射及丙泊酚暴露对大鼠海马CA1区树突棘的影响

11．6 海马内微注射及丙泊酚暴露对大鼠空间学习记忆能力的影响

11．7 海马内微注射及丙泊酚暴露对大鼠海马CA1区神经元形态的影响

11．8 海马内微注射及丙泊酚暴露对大鼠海马CA1区神经元内caspase-3表达的影响

12 讨论

13 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 全身麻醉药对神经发育期大脑的神经毒性的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简介