HSP90抑制剂NVP-AUY922诱导PTC细胞系凋亡及其作用机制的研究

摘要

目的:甲状腺乳头状癌(PTC)是甲状腺最常见的恶性肿瘤，其发病率近几年逐年升高，且增长速度很快。手术切除肿瘤目前是PTC最有效的治疗手段，虽然经过规范的手术治疗、术后的TSH抑制治疗及放射性碘治疗后PTC的预后较好，但仍有约5％的患者对放射性碘治疗产生抵抗，此类患者预后很差，目前还没有有效的治疗手段。热休克蛋白90(HSP90)是一种分子伴侣，因其部分客户蛋白在肿瘤细胞的生存和增殖中发挥重要作用，已成为肿瘤治疗的靶点。我们使用HSP90的特异性小分子抑制剂NVP-AUY922(AUY922)在体外作用于人PTC细胞的方法，研究AUY922对PTC细胞的增殖和凋亡的影响，并探讨其作用机制，为治疗难治性的PTC体重新的思路。
　　研究方法:体外培养人PTC细胞系IHH4和K1，使用不同浓度的HSP90抑制剂AUY922分别处理PTC细胞系12、24、36小时后，使用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测细胞增殖的变化;收集不同浓度AUY922处理24小时后的PTC细胞，AnnexinⅤ-FITC和PI双重染色后流式细胞仪检测凋亡细胞的比例变化情况;提取经过不同浓度AUY922处理24小时后的PTC细胞总蛋白，Western blot法检测不同浓度AUY922作用后PTC细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、cleavedcaspase-9、cleaved PARP及HSP90客户蛋白survivin等的表达变化情况;免疫沉淀法验证PTC细胞中HSP90与survivin的相互作用;通过脂质体转染法将survivin过表达质粒转染至PTC细胞系IHH4和K1中，并使用G418筛选稳定过表达survivin的新的PTC细胞系;qRT-PCR和Western blot法检测稳定过表达survivin细胞系中survivin的表达量;使用CCK-8法检测AUY922对稳定过表达survivin的PTC细胞的增殖的影响;使用AnnexinⅤ-PE和7-AAD双染法检测AUY922对稳定过表达survivin的PTC细胞的凋亡的影响;Western blot法检测AUY922处理后稳定过表达survivin的PTC细胞中凋亡相关蛋白表达的变化。
　　结果:CCK-8实验结果显示，经过不同浓度的AUY922处理PTC细胞系12、24、36小时后，细胞的增殖表现出了明显抑制现象，并呈现出时间依赖性和剂量依赖性;流式细胞术结果表明，不同浓度的AUY922处理PTC细胞24小时后凋亡的发生率随着浓度的增加而升高;通过Western blot检测AUY922处理后细胞中凋亡相关蛋白的变化情况验证了流式细胞术的结果，同时发现与凋亡抑制密切相关的HSP90客户蛋白survivin的表达随着AUY922浓度的增加而降低;免疫沉淀结果显示，PTC细胞中HSP90蛋白与survivin蛋白关系紧密;分别使用500ug/ml和400ug/ml浓度的G418筛选转染survivin过表达质粒后的PTC细胞获得了稳定过表达survivin的新的PTC细胞系IHH4/survivin和K1/survivin，未转染质粒的PTC细胞没有表现出G418抗性;qRT-PCR结果表明IHH4/survivin和K1/survivin较IHH4和K1细胞中survivin表达增加约52倍和163倍，同时Western blot结果显示IHH4/survivin和K1/survivin较IHH4和K1细胞总蛋白中survivin表达量明显升高;CCK、流式细胞术和Western blot结果显示IHH4/survivin和K1/survivin较IHH4和K1细胞对AUY922的抵抗力有明显增加，凋亡细胞的比例明显下降，凋亡相关蛋白cleaved caspase3的表达明显减少。
　　结论:HSP90小分子抑制剂AUY922对PTC细胞有较强的增殖抑制作用，且该作用具有时间和剂量依赖性;AUY922可以诱导PTC细胞发生凋亡，且HSP90的客户蛋白survivin在AUY922诱导的PTC细胞凋亡中发挥重要的作用。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2．1 实验材料

2．1．1 细胞株

2．1．2 主要药物及试剂

2．1．3 主要实验仪器及耗材

2．2 主要试剂配方

2．2．1 细胞培养所需培养基及试剂

2．2．2 蛋白免疫印迹(Western blot)所需试剂的配制

2．3 实验方法及操作

2．3．1 PTC肿瘤细胞的复苏及培养

2．3．2 PTC肿瘤细胞的换液

2．3．6 提取PTC细胞总蛋白

2．3．7 蛋白定量(BCA法)

2．3．8 蛋白免疫印迹(Western blot)

2．3．9 免疫沉淀(IP)

2．3．10 质粒抽提

2．3．11 质粒转染

2．3．12 筛选稳定转染细胞株

2．3．13 提取细胞总RNA

2．3．15 实时荧光定量PCR

2．4 统计学处理

3 结果

3．1 AUY922显著抑制PTC细胞系IHH4和K1的增殖

3．2 AUY922对人PTC细胞系IHH4和K1具有明显的凋亡诱导作用

3．3 AUY922使人PTC细胞系IHH4和K1细胞中survivin蛋白表达下调

3．4 AUY922可以减弱人PTG细胞中survivin与HSP90的结合

3．5 过表达survivn可以明显提高PTC细胞系IHH4和K1对AUY922的抵抗力

3．6 过表达survivin可以明显减弱AUY922诱导PTC细胞系IHH4及K1细胞发生凋亡的作用

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 热休克蛋白90抑制剂——一种新的甲状腺乳头状癌靶向药物

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历