COX-2特异性抑制剂NS-398对人胰腺癌增殖及肿瘤血管生成影响

摘要

目的:胰腺癌恶性度高，因早起症状隐匿而难以发现，发现时手术可切除率较低，对于该肿瘤治疗目前仍没有较好的治疗方法，因此需不断探索胰腺癌全新治疗方法。本试验旨在检测人胰腺癌细胞BxPC-3、SWI990、Capan-2、Aspc-1、Panc-1中COX-2、VEGF表达情况，观察NS-398对人胰腺癌细胞株在体外生长活力的影响，并选择适合的细胞系建立裸鼠人胰腺癌原位异种移植瘤模型，在体内进一步探讨COX-2特异性抑制剂NS-398对人胰腺癌的增殖抑制作用及对裸鼠异种原位移植瘤模型中瘤体血管生成的影响，初步探讨NS-398抗肿瘤血管生成的作用机制。
　　研究方法:以人胰腺癌细胞株BxPC-3、SWI990、Capan-2、Aspc-1、Panc-1为研究对象;其中COX-2及VEGF表达情况采用实时荧光定量PCR检测其mRNA表达、Western检测蛋白表达情况，琼脂糖电泳验证QPCR中DNA产物片段长度。四甲基偶氮唑蓝(MTT)法在体外检测不同浓度NS-398对人胰腺癌细胞增殖影响。基于体外实验结论筛选出最敏感细胞株建立裸鼠人胰腺癌原位移植瘤模型，裸鼠30只造模后随机分为2组，每组15只，对照组(术后15天每隔三日腹腔注射生理盐水0.2ml)，实验组(术后15天每隔三日腹腔注射NS-3986mg/kg)。进一步研究NS-398在体内的抑制作用及NS-398治疗组瘤体与对照瘤体大小差异，各脏器转移情况。标本行HE染色鉴定肿瘤，应用免疫组化技术检测胰腺癌组织中COX-2、VEGF蛋白表达情况及肿瘤微血管密度(MVD)测定。
　　结果:人胰腺癌细胞株BxPC-3、SW1990、Capan-2、 Aspc-1、Panc-1中均有COX-2及VEGF表达，QPCR检测结果显示，人胰腺癌细胞BxPC-3、SW1990、Capan-2、Aspc-1、Panc-1中COX-2 mRNA相对表达水平分别为1.0000±0.0322、0.1417±0.0422、0.5617±0.0931、0.0022±0.0414、0.0037±0.0312，VEGFmRNA的相对表达量分别为1.0000±0.0211、0.3197±0.0356、0.5443±0.0508、0.4054±0.0651、0.2444±0.0489。人胰腺癌细胞BxPC-3、SW1990、Capan-2、Aspc-1、Panc-1中COX-2蛋白相对表达水平分别为1.5910±0.0689、0.9577±0.0701、0.8972±0.0821、0.3638±0.0224、0.3923±0.0407。VEGF蛋白相对表达水平分别为1.0038±0.0291、0.6365±0.0599、0.6784±0.0434、0.4657±0.0616、0.4063±0.0588。
　　其中以Bxpc-3细胞表达较显著。MTT亦显示NS-398在体外可抑制人胰腺癌细胞增殖活性，呈时间-剂量依赖效应关系，并与细胞COX-2及VEGF表达强度有关，浓度在12.5-100umol/L时，随着浓度的增大和培养时间的延长吸光度值明显变小，COX—2及VEGF表达强度越高，药物对细胞生长活性的抑制作用越强。造模后30只裸鼠术后第一天死亡1只可能为麻醉意外，第二天死亡一只，接种后第57天，处死荷瘤鼠解刨观察原位移植瘤的生长。28只裸鼠25只胰腺均移植瘤生长，接种成功率89.28％，其中NS-398治疗平均组肿瘤的体积20.2152±4.8576mm3，对照组为204.4444±14.1408mm3，平均抑瘤率达90.11％。P=0.000。行HE染色证实为胰腺癌，免疫组化检测NS-398治疗组中COX-2、VEGF的表达水平均较对照组明显降低，TCOX-2=5.196，PCOX-2=0.035，TVEGF=4.427，PVEGF=0.021与对照组比较差异有统计学意义。VEGF与COX-2存在相关性，相关系数为0.828(P=0.03).MVD结果显示对照组计数平均值为27.4±7.7，治疗组计数为9.2±1.4，NS-398治疗组裸鼠肿瘤组织中MVD明显低于对照组，T=4.674，P=0.010，差异有统计学意义。MVD与COX—2及VEGF均呈正相关，相关系数分别为0.751(P=0.012)、0.642(P=0.046)。
　　结论:人胰腺癌细胞株中均有COX-2及VEGF表达，NS—398在体内外对人胰腺癌细胞均有增殖抑制作用，其抗癌机制之一可能是通过COX-2途径降低VEGF基因表达及抑制肿瘤组织血管生成有关。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2 材料和方法

2．1 主要细胞株和实验动物

2．1．1 细胞株

2．1．2 实验动物

2．2 主要试剂和仪器

2．2．1 主要试剂

2．2．2 主要仪器

3 主要溶液配制

4．1 细胞培养

4．2 采用实时荧光定量POR法检测人胰腺癌细胞株中COX-2、VEGFmRNA表达

4．3 采用Western-blot法检测人胰腺癌细胞株中COX-2、VEGF蛋白表达

4．4 MTT检测NS-398对人胰腺癌细胞增殖影响

4．5 荷瘤裸鼠人胰腺原位异种移植瘤模型的建立

4．6 动物实验分组及处理方法和结果判断

4．7 肿瘤组织石蜡切片制作及HE染色

4．8 免疫组化检测肿瘤组织COX-2、VEGF蛋白表达及MVD测定

4．9 统计学分析

5 实验结果

5．1 COX-2、VEGFmRNA在人胰腺癌细胞株的表达

5．2 COX-2、VEGF蛋白在人胰腺癌细胞株的表达

5．3 不同浓度NS-398对人胰腺癌细胞增殖的影响

5．4 造模后裸鼠及原位肿瘤生长情况

5．5 肿瘤组织病理学观察

5．6 免疫组化分析NS-398对肿瘤组织COX-2、VEGF表达影响及MVD测定

6 讨论

7 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 血管生成抑制剂在治疗胰腺癌中的研究进展

攻读学位期间取得的研究成绩

致谢

个人简历