微流控体系下神经胶质细胞分化条件的筛选、调控及机制研究

摘要

目的:中枢神经系统脱髓鞘疾病是中枢神经系统以广泛原发性脱髓鞘为主的一组疾病，包括多发性硬化、急性播散性脑脊髓炎、Guillian-Barre综合征、漫性脑硬化以及早产儿脑室周围白质软化病等。该疾病源于少突胶质细胞受损或发育障碍导致髓鞘损伤或脱失，从而影响神经冲动的传导、使得神经功能失调。目前，多数脱髓鞘疾病只能对症治疗，缺乏根治手段，且致残率很高，给患者及其家庭带来了沉重的负担。因此，探究少突胶质细胞的再生、调控情况，对中枢神经系统脱髓鞘疾病的治疗有重要意义。
　　国内外研究均表明，干细胞治疗是一种极具潜力的治疗中枢神经系统脱髓鞘疾病的方法。目前发现，神经干细胞(NSCs)通过分化为少突胶质细胞，替代损伤的神经细胞，以达到减少功能缺损的目的。NSCs的这种分化潜能为治疗神经系统脱髓鞘疾病带来了希望，也显示了NSCs治疗脱髓鞘疾病的应用前景。
　　然而，目前应用NSCs临床治疗仍有许多困难，源于对NSCs分化条件不清楚、调控机制不明、缺乏控制移植后NSCs分化和生长情况的方法等。大量研究表明，NSCs对微环境中生化和物理条件的变化十分敏感，因而微环境对于NSCs的影响是成为当今研究的热点。离体研究（细胞模型）证据显示，通过调节NSCs微环境中营养因子、细胞-细胞间的联系、细胞与细胞外基质(ECM)的相互作用，均可以调控NSCs自我更新或诱导向特定细胞群分化。在体研究（动物模型研究）中由于目前难以实现体内的实时监测，并且有通量低、花费高、劳动强度高、实验成本高等局限性。而现有的NSCs体外模型，仍缺乏能够有效控制NSCs微环境的手段，很大程度上限制了NSCs研究的发展。
　　本研究引入微流控芯片技术，利用其高通量筛选、精确的流体操控速度、细胞消耗量少、可实现长期培养、高度整合等优点，构建NSCs多种培养微环境的模型，用于筛选NSCs分化的条件。
　　研究方法及结果:所用微流控芯片为一种组装型微流控装置，由微流通道、细胞培养室阵列及刚性玻璃盖片组成，可同时进行多条件下的细胞平行培养。自提取NSCs，经鉴定，能够表达NSCs特异性蛋白(Nestin、SOX2)，诱导后可分化为神经元（β-tubulin-Ⅲ阳性）、星形胶质细胞(GFAP阳性)和少突胶质细胞(SOX10阳性)。NSCs在芯片上的培养分为5组，即2D培养、胶原表面2D培养、单细胞包胶培养、细胞球培养和细胞球包胶培养。与此同时，我们也进行了静态和灌流培养。应用NSCs完全培养基（含EGF、bFGF），对灌流与静态分别的五种培养方式的NSCs培养4天，观察NSCs在不同微环境中细胞活性、自我更新和增殖情况。结果表明在静态培养下，活细胞平均百分比分别由99.01％(2D培养组)和98.06％（胶原表面2D培养组）下降至73.56％（单细胞包胶培养组）、65.84％（细胞球培养组）和61.70％（细胞球包胶培养组），并且2D培养组的活细胞百分比明显高于细胞球培养组、胶原表面2D培养组的活细胞百分比明显高于单细胞包胶培养组;在灌流培养条件中，活细胞平均百分比分别为73.87％（2D培养组）、72.87％（胶原表面2D培养组）、70.79％（单细胞包胶培养组）、70.02％（细胞球培养组）和71.60％（细胞球包胶培养组）。通过计算Nestin阳性表达细胞占总细胞的百分比来评价NSCs的自我更新能力。结果表明NSCs在微流控芯片的不同培养条件下，表现出不同的自我更新能力，无论是灌流还是静态培养，细胞球包胶培养组都具有最高的自我更新能力。在灌流条件下，细胞球包胶培养组的自我更新能力分别高于2D培养组的0.02倍，胶原表面2D培养组的14.33倍，单细胞包胶培养组的1.09倍，细胞球培养组的0.44倍。在静态条件下，细胞球包胶培养组的自我更新能力分别高于2D培养组的0.46倍，胶原表面2D培养组的27.50倍，单细胞包胶培养组的0.19倍，细胞球培养组的0.16倍。通过计算Ki-67阳性细胞占总细胞的百分比来评价NSCs增殖能力，结果表明，在灌流和静态条件下，胶原表面2D培养组的Ki-67的表达始终是最低的。灌流条件下，单细胞包胶培养组具有最高的Ki-67阳性细胞百分比。静态条件下，细胞球包胶培养组表达最显著，与Nestin表达的变化趋势相一致。
　　应用NSCs分化培养基（不含EGF、bFGF），对灌流与静态下五种培养方式的NSCs分别培养4、7、14天。为评价培养条件对NSCs分化的影响，我们应用实时荧光定量聚合酶链反应从核酸水平检测分化相关基因表达。通过基因MAP2和TUJ1的表达量评价NSCs向神经元的分化。静态条件下，4、7、14天NSCs向神经元的分化表达量，2D培养组大于细胞球培养组，胶原表面2D培养组大于单细胞包胶培养组。我们进一步对灌流和静态条件下，2D培养组和胶原表面2D培养组进行考察，发现2D静态条件可能更有利于NSCs向神经元分化。在培养4、7、14天后，静态条件下2D培养组的神经突起的长度分别为67、84、55μm，并且有突起细胞的细胞数占总细胞数的百分比达22.32％、23.93％、4.36％。然而，静态条件下无论是神经轴突长度还是有突起细胞数的百分比，2D培养组优于胶原表面2D培养组。我们的研究中，NSCs向星型胶质细胞分化的特异性指标为ALDH1L1、GFAP。静态条件下，ALDH1L1和GFAP基因在胶原表面2D培养组的表达量均高于单细胞包胶组、细胞球培养组高于2D培养组。细胞球培养组ALDH1L1和GFAP基因的高表达在灌流条件下尤为显著。然而，对于胶原表面2D组，灌流条件下几乎不表达ALDH1L1、GFAP基因。选择MBP和SOX10作为NSCs向少突胶质细胞分化的指标。静态条件下，MBP和SOX10基因在胶原表面2D组的表达量均高于单细胞包胶组、细胞球培养组高于2D培养组。细胞球培养组MBP和SOX10基因的高表达在灌流条件下尤为显著。然而，对于胶原表面2D组，灌流条件下几乎不表达MBP、SOX10基因。
　　近年来，有关中药对神经系统疾病治疗的研究取得了快速发展。传统中药及其有效成分具有毒副反应小、作用缓和持久、价廉、安全等优点。基于第一部分构建的NSCs条件培养体外模型，及所筛选的促少突胶质细胞分化的培养条件（本部分选择NSCs细胞球灌流培养条件）进一步应用天然活性药物（梓醇、刺五加）对NSCs进行诱导，深入研究NSCs的少突胶质细胞向分化潜能。筛选出促NSCs少突胶质细胞分化的最佳药物浓度，并对NSCs向少突胶质细胞分化的机制进行初步探究。
　　我们构建了一种能生成连续药物浓度梯度的微流控芯片，用于评估不同浓度的梓醇、刺五加对NSCs活性的影响以及向少突胶质细胞分化的情况。结果表明，梓醇、刺五加在0-3 mg/ml的浓度下，对NSCs没有毒性作用。梓醇能明显促进NSCs向少突胶质细胞分化。根据这一现象，对梓醇促进NSCs向少突胶质细胞分化的信号通路进行研究。发现随着NSCs向少突胶质细胞分化的增多，其Cav-1的表达量随之下降。为了阐明梓醇是通过抑制Cav-1信号通路，进而促进NSCs向少突胶质细胞分化，我们应用Cav-1特异性抑制剂β-环糊化精，抑制Cav-1，结果发现少突胶质细胞相关基因表达明显升高。由此说明梓醇通过抑制Cav-1，可以促进NSCs向少突胶质细胞分化。该体系为体外研究中药活性成分对NSCs少突胶质细胞向分化的作用机制提供平台。
　　结论:本课题第一部分成功构建了微流控芯片介导的NSCs体外模型。该模型为一种组装型、多条件平行培养微流控装置，能够同时评估多种培养条件对NSCs自我更新、增殖和分化等细胞学命运的影响，筛选出有利于NSCs定向分化的最优培养条件。基于第一部分筛选的促NSCs少突胶质细胞分化培养条件，进一步应用天然活性药物诱导NSCs定向分化，并发现梓醇可通过抑制Cav-1信号通路促进NSCs向少突胶质细胞分化的内在机制。综上，本研究提供的NSCs培养模型为临床前期开展NSCs替代治疗提供了依据和可行的技术支撑，也为下一步器官芯片的研究提供了新思路。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：微流控芯片介导的NSCs体外模型的构建及其对影响NSCs功能的微环境因素研究

1 前言

2．1 材料

2．2 实验方法

3．1 NSCs的鉴定

3．2 微流控芯片介导的NSCs体外模型的构建

3．3 在微流控芯片构建的微环境中NSCs的活性检测

3．4 在微流控芯片构建的微环境中NSCs的自我更新和增殖

3．5 在微流控芯片构建的微环境中NSCs的分化情况

4 讨论

5 结论

第二部分：梓醇对NSCs向少突胶质细胞分化的研究

6 前言

7 材料与方法

7．1 主要试剂和仪器

7．2 实验方法

8 结果

8．1 浓度梯度芯片的构建

8．2 药物对NSCs活性的影响

8．3 芯片上NSCs药物诱导向少突胶质细胞分化的分析

8．4 梓醇对Cav-1表达的影响

8．5 梓醇通过下调Cav-1通路促进NSCs向少突胶质细胞分化

9 讨论

10 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 微流控芯片技术在干细胞研究中的应用

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历