肾集合管形态发生三维可视化及转运功能与亚细胞结构研究

摘要

目的：肾脏集合管系统是由胚胎时期一个简单的上皮芽，即输尿管芽(UB)，反复分支形成。哺乳动物肾脏的发生始于UB的侵入，是UB与后肾间充质(MM)相互作用的结果。MM诱导UB的侵入、分支和生长。与此同时，UB诱导MM在其末端聚集，通过间质-上皮转分化形成肾单位。肾单位通过连接小管(CNT)汇入UB，即成熟分化后的集合管。集合管在皮质内经历最后一级分支，形成两支初始集合小管(ICT)。在汇入集合管的过程中，一部分肾单位会共用一个CNT，形成弓形管(Arcade)与ICT相连，其余肾单位则直接汇入ICT。普遍认为，UB末端反复二权分支(Branching)是成年肾集合管树状结构的形态发生基础，UB分支数目决定了肾单位的数目，即UB末端形成的分支越多，诱导产生的肾单位数目则越多。由于肾单位具有血压调节能力，因此当发育异常或缺陷引起UB末端分支减少时，肾单位数量的减少极有可能在成年时期诱发肾源性高血压以及肾衰竭。然而，迄今还没有一项研究证明肾单位的数目与UB分支数目存在着固定比例关系。这是由于在UB发育过程中，其二杈分支的模式尤其是在肾发生晚期出现了一些复杂变化，使体内及体外研究都面临局限性。正因如此，分支机制的研究虽已延续数十年，仍尚无定论。上世纪60年代显微解剖研究发现，人类胚胎肾脏中UB的末端分支模式并不贯穿肾脏发生的全过程:随后的研究也证实，当UB分支的末端与诱导产生的肾单位相连，就终止了UB末端的继续分支。除了末端分支，近期研究发现，在肾发生早期，还存在另一种发生频率较低的分支模式，即出芽(Sprouting)。不同于分支，出芽是指从一个已经存在的主干等间距或者随机产生侧枝。出芽模式通常决定器官的小叶结构，比如在乳腺、唾液腺和胰腺，而这种分支模式也被认为在血管包括毛细血管网的发生发育中存在。因此，从紧密调节肾单位发生，确保肾单位数量的角度，在肾发生的晚期，肾集合管树的形成可能需要出芽模式形成芽泡，并诱导肾单位的发生。UB最早分化形成芽泡顶端(Tip)和茎(Stalk)，两者在基因表达模式上有明显区别。许多芽泡表达的特定基因都参与UB生长和分支，而茎部特异性基因在集合管的成熟中发挥作用，比如离子通道的形成。茎进一步延伸分化形成干(Trunk)， UB干部呈现分化更为成熟的表型。当UB分化成熟为集合管系统时，上皮细胞形成两种不同的类型----主细胞和闰细胞。闰细胞有A型、B型和NonA-NonB三种亚型，其中NonA-NonB型闰细胞在不同种属中分布比例和微细结构均有所不同。三种亚型闰细胞皆有质子ATP酶(H+-ATPase)的表达。在细胞功能分化过程中，主细胞的水通道蛋白-2(AQP-2)是集合管细胞首先表达的标志蛋白之一。一些结构蛋白如Claudin-7，在发育集合管上有较丰富的表达，作为紧密连接蛋白Claudin家族的成员，它在建立上皮屏障以及旁分泌转运的调节中发挥重要作用。研究表明，成熟的集合管在应对代谢变化时可以重塑其细胞群，如主细胞和闰细胞，且在细胞培养时，这些细胞类型表现出相当大的可塑性和互变现象。在集合管上皮形成过程中，两种细胞在数量比例、形态及功能方面的正常分化，对于肾脏正常发育、机体水盐及酸碱平衡调节等生理功能的实现至关重要。本研究在组织学连续切片并染色基础上，采用计算机可视化技术，以成年集合管树空间结构及其与肾单位相连的特殊排列顺序做为形态参照，对胚胎(E)14.5，E17.5，生后(P)7天UB树的空间结构进行推演比较，并结合更多时间点二维图像的观察，分析集合管树（早期的UB）形态发生的过程以及可能存在的分支模式。此外，在发育集合管三维可视化基础上，对其上皮的亚细胞结构、转运功能(AQP-2及H+-ATPase的表达)，细胞转运旁路的屏障结构（Claudin-7表达），以及UB增殖状态（增殖细胞核抗原PCNA表达）等分别进行了研究，旨在探索集合管上皮细胞结构及功能成熟的时空规律。
　　方法：⑴获取小鼠不同时间点肾组织2.5μm厚树脂(E17.5，P7，P56)或5μm厚石蜡(E14.5，P1，P5)连续切片。采用图像采集系统将连续切片转为数字显微图像后，经自编软件配准，再输入到计算机Linux系统，采用定制的C语言程序实现小管的数字追踪。集合管的追踪始于肾乳头管，止于肾单位远端小管。肾小管的追踪始于汇入集合管的肾单位的远端部分，止于肾小体尿极近端小管。将追踪得到的坐标数据集输入到三维可视软件中，显示并分析集合管分支的空间走行及其与肾小管的毗邻关系。⑵在集合管走行可视化基础上，取代表皮质及髓质多个平面的2.5μm厚树脂切片，树脂再包埋，获取50nm超薄切片，透射电镜下，与成鼠集合管对比观察发育过程中集合管超微结构。⑶选取连续石蜡切片中目标切片，采用改良的免疫组织化学方法，检测发育肾集合管细胞转运旁路的屏障结构蛋白Claudin-7，以及主细胞和闰细胞转运功能蛋白AQP-2和H+-ATPase的表达，观察两种细胞的分布并计数集合管上皮细胞中主细胞所占百分比。此外，利用PCNA与AQP-2免疫荧光双标染色，在肾组织不同区域计数集合管两种细胞的增殖指数。
　　结果：①UB的所有分支都是在MM区域形成（包括生肾区）;UB侵入后的MM变成梯状的间充质。②E14.5时UB树状雏形已基本构建，其中，UB在6～9级分支时开始诱导肾单位;从E14.5到E17.5，UB至少又经历两次分支;而到了P7，UB系统已基本具有成年鼠肾的集合管模式。③与以往观察不同的是，UB末端分支在贯穿整个肾单位发生过程中，形成的两端芽泡都与肾单位相连（而不是一端诱导肾单位，另一端继续分支）。通常两侧连接的肾单位的发育阶段略有先后。连接肾单位的数目在早期（如E14.5）多为一个，出生前后（如E17.5）则常见一个芽泡诱导形成两个肾单位。④发育至成年，与皮质集合管相连的ICT、弓形管及肾单位出现了较为规律的时空排列顺序：弓形管连有4～5个肾单位，其中，最早发生的肾单位（肾小体位于近髓质的皮质）总是连在弓形管的最远端（连接处距离肾被膜最远）；随后发生的肾单位则依序由远至近连在弓形管近侧端（离肾被膜近）；弓形管连接一支ICT，在中间皮质浅层汇入皮质集合管；另一支ICT在被膜下的皮质中走行一段距离，且与2～3个浅层皮质肾单位相连，其最末端连着最晚发生的肾单位。⑤UB芽泡与UB茎上皮细胞呈现结构上的差异性。芽泡细胞形态较规则，呈楔形，排列紧密，核浆比例大，期间偶见“亮”细胞;与此相比，邻近的芽茎细胞相对较矮小，排列较紧密，管腔较小，散在“亮”细胞，而整个UB干部细胞在肾脏不同区域呈现多形性。E17.5电镜观察，芽泡细胞电子密度高，细胞器散在分布，主要为小而密集的线粒体、丰富的游离核糖体、粗面内质网和高尔基复合体;UB茎和干部上皮细胞电子密度则有明显的高低之分，但尚无主细胞和闰细胞的典型超微结构特征。P7电镜观察显示，在集合管(发育后期的UB)上已有较成熟的闰细胞结构特征，如游离面的微绒毛、胞质中的小泡、散在的线粒体等，但尚未形成典型的主细胞结构，如基底的质膜内褶。⑥Claudin-7在早期UB包括芽泡和茎的上皮细胞基侧面，均有表达。与之不同的是，UB芽泡在肾发生终止前(P5)，始终没有AQP-2和H+-ATPase的表达;而UB茎的上皮细胞在E17.5已有两种蛋白的表达。其中，AQP-2阳性标记的主细胞所占集合管上皮细胞的比例(％)在皮质、外髓和内髓分别为70.58±4.07、77.11±1.45、90.85±0.61，这种趋势一直保持到成年。⑦集合管上皮细胞增殖指数，随着小鼠肾组织的发育呈降低趋势，在这下降过程中，集合管细胞在皮质中的增殖指数高于外髓;在皮质中，主细胞的增殖指数高于闰细胞;而在外髓中，主细胞增殖指数在P7时高于闰细胞，发育至成年则与闰细胞增殖指数相当，均较低。
　　结论：⑴通过对比成年集合管树空间结构、形态及其与肾单位相连的特殊排列顺序，发生发育UB形态发生的三维可视化结果提示:UB发育形成弓形管后，以出芽方式诱导肾单位的形成，同时，也以出芽方式形成另一支ICT，后者在生肾区继续以出芽方式形成新的芽茎和芽泡并诱导肾单位，直到生后5天肾单位停止发生。⑵根据上述UB出芽诱导肾单位发生的模式、转运蛋白的表达与亚细胞结构分析，芽泡和芽茎构成成年肾脏CNT的主要来源。但在肾单位发生停止之前(P5)，芽泡并不具有成年集合管的转运功能，而此时芽茎具有成年集合管相同但较弱的转运功能，尽管其典型形态结构特征尚未形成。而整个UB干对水及离子转运功能从发育阶段到成年表现出明显的区域差异性。

目录

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摘要

英文缩略语

第一部分：发育小鼠肾树状集合管分支的三维可视化研究

1 前言

2．1 材料

2．2 方法

3．1 集合管三维追踪并可视化

3．2 发育早期集合管分支的三维重建

3．3 出生前集合管树状结构可视化

3．4 新生及肾发生终止时被膜下集合管的分支

3．5 肾发生终止后集合管的三维可视化

4 讨论

5 结论

第二部分：发育小鼠肾集合管功能蛋白表达与亚细胞结构的研究

6 前言

7．1 材料

7．2 方法

8 结果

8．1 胚胎期集合管功能蛋白表达与上皮亚细胞结构

8．2 生后7天集合管功能蛋白表达与上皮亚细胞结构

8．3 发育肾集合管上皮细胞中主细胞的百分比

8．4 发育肾集合管上皮细胞增殖指数

9 讨论

10 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 肾输尿管芽分支形态发生的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历