长期低浓度镉暴露对A549细胞生物学行为的影响及其机制的研究

摘要

目的:镉是环境中常见的重金属毒物，被国际抗癌联盟(IARC)定为IA级致癌物，即“人类的致癌物”。然而，目前对长时间（超过1个月）镉暴露的对肺癌细胞的影响，尚不清楚。本研究旨在探讨长期低浓度镉暴露对肺腺癌细胞外显子突变情况、转录组的表达和蛋白质的差异性表达的影响，以期为进一步揭示长期低浓度镉暴露对肺癌细胞的相关分子机制提供重要的基础实验数据。
　　研究方法:研究中所用的A549细胞经短串联重复(STR)验证细胞类型，排除杂细胞污染。将A549细胞置于添加有CdCl2（终浓度为1μM）的DMEM培养基中，持续培养8个月（设为实验组，以下称为A549-Cd组），置于未添加CdCl2的普通DMEM培养基中持续培养8个月的A549细胞作为对照组（以下称为A549-H0组），分别提取A549-Cd组和A549-H0组细胞的DNA、总RNA和总蛋白，其中的DNA和总RNA利用Illumina HiSeq3000测序平台进行检测全外显子和转录组测序，总蛋白进行二维电泳后，提取具有明显差异的蛋白质斑点，经Autoflex speedTM MALDI-TOF-TOF质谱仪进行质谱分析，供差异蛋白比对所用。
　　结果:STR鉴定结果证实本研究所用细胞符合ATCC最初建系时的状态，同时也排除了细胞在长期培养过程中可能发生的交叉污染。A549-Cd组和A549-H0组全外显子测序结果表明，低浓度CdCl2长期暴露的A549-Cd组独有的SNP位点共4222个，其中非同义突变位点有382个。对非同义突基因进行功能注释后发现，其中有78个基因与细胞迁移能力有关。GO分析结果显示，低浓度CdCl2长期暴露后的突变基因与钙调素结合功能、微丝运动功能、钙离子结合功能、细胞骨架组成、肌动蛋白相关生物过程、细胞粘附以及运动等生物学过程明显相关。KEGG分析结果显示所涉及的突变基因与化学致癌通路相关。A549-Cd组和A549-H0组转录组测序结果显示，A549-Cd组的所具有的差异表达基因共有1250个，其中784个基因表达上调，466个基因表达下调。在mRNA方面，A549-Cd组的差异表达的mRNA共1623个，1023个表达上调，591个表达下调。其中与钙离子结合以及细胞粘附相关的差异表达基因有132个，表达上调基因85个，下调基因47个。与肿瘤相关差异表达基因97个，表达上调基因67个，下调基因30个。GO分析结果显示，低浓度CdCl2长期处理组差异表达基因集中在包括钙离子结合功能、细胞黏附、DNA与蛋白质装备等在内的多个领域。KEGG综合分析CdCl2长期处理组的差异表达基因，结果表明与多个肿瘤相关通路以及化学致癌等相关。在lncRNA方面，A549-Cd组共679个IncRNA存在差异表达，其中375个lncRNA表达上调，304个表达下调。此外，本研究还新发现了171个新lncRNA，其中102个表达上调，69个表达下调。2-D电泳结果显示，有34个出现显著改变的蛋白质斑点，其中11个斑点表达明显降低，23个斑点表达量显著增加。对有统计学意义的斑点进行质谱分析和鉴定，成功鉴定出11个不同的蛋白质斑点。其中，K1C18、HS90A、HSPB1以及SYWC(Tryptophanyl-tRNAsynthetase)与细胞凋亡、迁移能力以及肿瘤分化程度和预后相关。
　　结论:本研究利用第二代测序技术和2D电泳-质谱技术，对长期低浓度镉暴露的肺癌细胞A549的相关外显子突变情况、基因表达情况和lncRNA表达情况进行了较为全面的检测，有望为进一步揭示长期低浓度镉暴露变所致的相关信号通路提供重要的基础实验数据。

目录

声明

摘要

英文缩略语

1 前言

2 材料和方法

2．1．2 主要仪器

2．2 实验方法

3 实验结果

3．1 细胞短串联重复(STR)鉴定结果

3．2 长期镉暴露对A549细胞外显子组基因的影响

3．2．1 突变位点的检测和注释

3．2．2 变异基因GO和KEGG分析

3．3 长期镉暴露对A549细胞转录组基因的影响

3．3．1 A549-Cd组和A549-H0组的基因表达差异

3．3．2 表达差异基因的GO和KEGG分析

3．4 长期镉暴露对A549细胞蛋白表达的影响

4 讨论

本研究创新型的自我评价

参考文献

综述 镉的致癌毒性及其相关机制的研究进展

致谢

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