创伤性脑损伤后Sirt1和MAPKs信号通路相互作用对星形胶质细胞活化的影响

摘要

目的:星形胶质细胞在创伤性脑损伤(traumatic braininjury，TBI)后活化并变成反应性星形胶质细胞，它们合成的胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidicprotein，GFAP)增多，通过用GFAP免疫组织化学方法在灰质和白质内可以看到星形胶质细胞肥大。星形胶质细胞伸出突起，沿着损伤边界朝着损伤部位迁移。当这些突起遇到活化的炎性细胞和浸入的间质细胞时，它们限制炎性区域，但并不能超过损害边界。在损伤周围，它们分泌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)分子，用于形成基膜或重新构成胶质界膜。在远离轴突变性的区域也可有反应性星形胶质细胞，它们与轴突、神经元或小胶质细胞之间的细胞间通讯可以成为触发因子。
　　Sir2(Silent Information Regulator2)是sirtuin（SIRT）家族最早是1984年在酵母菌中作为一个可保持染色体沉默的高度保守基因组被发现的。已证实在酵母菌中Sir2的过表达可以通过DNA的修复延长寿命。Sirtuins归属于组蛋白去乙酰化酶3(histone deacetylase，HDAC)家族。SIRT1是哺乳动物Sir2的直系同源物，它是一个细胞核蛋白并且涉及调节许多细胞内过程，包括凋亡、细胞衰老、内分泌信号、糖稳态、老龄化和长寿。在人类和啮齿类动物中，七种结构和功能不同的组蛋白去乙酰化酶已被确定(SIRT1-SIRT7)。它们分别位于不同的亚细胞区，包括细胞核、细胞质和线粒体等。SIRT1去乙酰酶的活性是通过烟酰胺抑制和通过白藜芦醇激活。此外，SIRT1蛋白活性可能是通过磷酸化作用调节，因为在体外Ser27和Ser47位点可被磷酸化，然而，这些磷酸化位点的功能还没有被确定。Sirt1可调节机体多种器官的寿命。Sirt1在胚胎脑组织中的表达水平特别高，在发育和成年哺乳动物脑组织中也有表达，提示sirt1对神经元进化有影响。Araki等证实，在小鼠神经细胞中，Sirt1蛋白能延缓神经细胞轴突降解，而这种降解往往发生于接触化学药物或从细胞体断离的神经细胞轴突，表明Sirt1对神经元也有保护作用。Sirt1通过对不同刺激的调节参与众多病理过程，如老化、代谢性疾病、神经退行性疾病、癌症、心血管功能障碍等，它主要存在于细胞核和细胞质中，其激活状态可导致其亚细胞定位的转变，其中核质穿梭非常。近期研究发现Sirt1是主要存在于细胞质中，而磷酸化Sirt1(p-sirt1)仅局限于核，此外，DNA损伤引起的再分配使Sirt1离开DNA损伤位点的沉默序列和基因启动子，进而改变在细胞内的位置，这些变化可能在SIRT1的功能调节中发挥作用。
　　丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。细胞外调节激酶(extracellular signal-regulatedkinase，ERK)，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38信号通路是MAPKs家族中的重要成员。研究证实，这些信号转导通路存在于大多数细胞内，在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应（如细胞增殖、分化、转化及凋亡等）的过程中具有至关重要的作用。
　　近年来研究发现，Sirt1的去乙酰化和MAPKs(ERK，JNK和p38)的磷酸化之间可以相互作用彼此影响，但具体机制尚未清楚，尤其是其在脑损伤后星形胶质细胞活化的作用机制更是研究甚少，因此，本课题就Sirt1和MAPKs信号通路之间相互作用对脑损伤后星形胶质细胞活化表达影响的机制进行探究，为脑损伤后胶质细胞过度活化导致的神经损伤提供新的治疗靶点。
　　研究方法:体外实验:取出生1-3天的小鼠乳鼠大脑皮质培养星形胶质细胞，免疫细胞化学荧光染色GFAP蛋白表达对培养的星形胶质细胞的纯度进行鉴定。IL-1β刺激星形胶质细胞活化，应用Sirt1激动剂——白藜芦醇(Resveratrol，Res)，MAPK信号通路抑制剂U0126，SP600126和SB203580分别进行干预，对照组为同剂量浓度的抑制剂溶剂DMSO。免疫细胞化学荧光染色对星形胶质细胞进行形态学检测，western blot技术检测星形胶质细胞中GFAP, Sirt1，p-ERK，p-JNK和p-p38的蛋白表达，ELISA检测活化后星形胶质细胞中炎症因子IL-1β，IL-6和TNFα的含量。
　　体内实验:制各小鼠黑质纹状体通路损伤模型，侧脑室给予白藜芦醇(Resveratrol，Res)，MAPK信号通路抑制剂U0126，SP600126和SB203580进行干预，对照组为同剂量浓度的溶剂DMSO。Western blot技术检测损伤周围组织GFAP, Sirt1和MAPK信号通路中关键蛋白p-ERK，p-JNK和p-p38的经时活化表达;免疫组织化学荧光双重染色技术检测损伤周围Sirt1和MAPK信号通路中关键蛋白p-ERK，p-JNK和p-p38在星形胶质细胞中的活化表达;ELISA检测损伤周围组织中炎症因子IL-1β，IL-6和TNFα的表达量;动物行为学如平衡木实验，抓力测试，损伤后神经功能评分等检测损伤后给予白藜芦醇，MAPK信号通路抑制剂U0126，SP600126和SB203580对神经功能恢复的影响。
　　统计学分析采用GraphPad Prism5软件进行统计，数据以均数±标准误表示。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较用Bonferroni检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:体外实验:1、western blot发现IL-1β刺激后星形胶质细胞GFAP蛋白表达明显增加，荧光染色显示IL-1β刺激后星形胶质细胞中GFAP阳性表达增强且形态学有明显改变，如胞体肥大，突起减少等符合反应性星形胶质细胞活化的特征性改变。2、活化后的星形胶质细胞中Sirt1蛋白表达明显减少，且p-ERK，p-JNK和p-p38蛋白表达水平明显增高。3、应用Sirt1激动剂——白藜芦醇提高Sirt1表达，以及MAPKs信号通路抑制剂，可明显降低星形胶质细胞GFAP水平且胞体肥大、突起缩短变粗减少的细胞形态明显改善。4、白藜芦醇可以提高p-ERK并抑制p-JNK和p-p38蛋白的表达;抑制MAPKs信号通路活化后均可提高Sirt1蛋白的表达，且JNK信号通路抑制剂SP600125提高Sirt1蛋白表达的效果最为显著。
　　体内实验:western blot结果显示损伤后GFAP蛋白表达明显增高，Sirt1蛋白表达减少，且ERK，JNK，p38信号通路均发生活化;荧光染色发现，损伤周围的星形胶质细胞GFAP阳性表达强烈，胞体肥大，突起缩短且减少并向损伤区域聚集;白藜芦醇可以提高Sirt1蛋白的表达，减弱损伤周围星形胶质细胞的活化并调节ERK，JNK和p38信号通路的活化表达，其中促进ERK信号通路的活化但是抑制JNK和p38信号通路的活化;应用MAPKs抑制剂后，在减弱星形胶质细胞活化的同时可以提高Sirt1的表达，提示脑损伤后Sirt1和MAPKs信号通路活化具有一定的相互关联，此结果与体外培养脑皮质星形胶质细胞结果一致;ELISA检测结果显示损伤后IL-1β，IL-6和TNFα表达量明显增加，应用白藜芦醇或者MAPKs信号通路抑制剂后IL-1β，IL-6和TNFα表达量明显减少，提示提高Sirt1表达或者抑制MAPKs信号通路活化可以抑制损伤导致的炎症因子表达;动物行为学检测结果显示，白藜芦醇或者MAPKs信号通路抑制剂，均对损伤后神经功能的恢复具有一定的促进作用。
　　结论:1、IL-1β可刺激体外培养的脑皮质星形胶质细胞活化。2、活化的星形胶质细胞Sirt1表达降低，ERK，JNK和p38信号通路发生活化。3、抑制MAPKs信号通路或者提高Sirt1表达，可以减弱星形胶质细胞活化表达。4、黑质纹状体通路损伤导致损伤周围星形胶质细胞发生活化，MAPK信号通路活化，Sirt1表达下降。5、应用MAPK抑制剂或者Sirt1激动剂后，可以明显减弱损伤周围星形胶质细胞活化表达程度，减少损伤周围炎症因子的表达，促进动物行为学神经功能的恢复。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：Sirt1和MAPK信号通路参与IL-1β诱导的体外脑皮质星形胶质细胞活化

1 前言

2．1 主要试剂和仪器

2．2 主要研究对象和分组

3．1 星形胶质细胞的鉴定

3．3 Sirt1参与IL-1β诱导的星形胶质细胞活化表达

3．4 MAPK信号通路参与IL-1β诱导的星形胶质细胞活化表达

3．5 U0126，SP600126以及SB203580对MAPK信号通路的抑制作用

3．6 抑制MAPK信号通路活化可减弱IL-1β诱导的星形胶质细胞活化表达

3．8 抑制MAPKs信号通路活化对Sirt1表达的影晌

4 讨论

5 结论

第二部分：黑质纹状体通路损伤后白藜芦醇的神经保护作用与JNK信号通路活化的研究

6 前言

7．1 主要试剂和仪器

7．2 研究对象和分组

8 结果

8．1 黑质纹状体通路损伤模型的鉴定

8．2 白藜芦醇对黑质纹状体通路损伤后神经功能的影响

8．3 白藜芦醇对损伤后纹状体神经元凋亡的影响

8．4 白藜芦醇对损伤后MAPKs信号通路活化的影响

8．5 白藜芦醇对黑质纹状体通路损伤后炎症因子表达的影响

8．6 抑制JNK信号通路的活化可减弱白藜芦醇对损伤后的神经保护作用

9 讨论

10 结论

第三部分：Sirt1和MAPK信号通路在黑质纹状体通路损伤后星形胶质细胞活化中的相互作用

11 前言

12．1 主要试剂和仪器

12．2 研究对象和分组

13 结果

13．1 黑质纹状体通路损伤模型的鉴定

13．2 黑质纹状体通路损伤后星形胶质细胞的活化

13．3 黑质纹状体通路损伤后对Sirt1表达的影响

13．4 黑质纹状体通路损伤后MAPKs信号通路的活化

13．5 白藜芦醇对损伤导致的星形胶质细胞活化的影响

13．6 白藜芦醇损伤后MAPKs信号通路活化的影响

13．7 MAPKs信号通路抑制剂对星形胶质细胞活化的影响

13．8 白藜芦醇和MAPKs信号通路抑制剂对损伤后神经功能的影响

14 讨论

15 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 Sirt1参与中枢神经损伤后神经再生修复机制的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简历