早期高压氧在CCI大鼠的镇痛作用与NO-cGMP-PKG信号的激活

摘要

目的:
　　神经病理性疼痛在人群中的发病率高，患者的生活质量受到严重的影响，解决因此给患者带来的痛苦是十分迫在眉睫的，神经病理性疼痛目前逐渐进入人们的视线，公众及各医疗机构也明显对其进行了关注和重视。在国际上，普通人群中的神经病理性疼痛的发病率达到了7％，仅在中国就约有9千万患者，其不断的饱受此病症的煎熬。由于该病通常会带来常人无法承受的剧烈疼痛，所以会极大的影响患者的工作和生活，随着严重下降的生活质量，长期的疼痛甚至还会导致患者出现厌世、抑郁、躁狂及焦虑等精神问题。神经病理性疼痛的发病机制极其复杂多样，目前几乎没有有效的治疗手段和特效的治疗药物，因此探讨神经病理性疼痛的产生与发展的机制，寻找有效的诊疗和控制方法，成为临床工作者需要重点关注及亟待解决的问题。
　　在临床上，高压氧(HBO)被广泛使用于脊髓损伤及修复等疾病的治疗，并发现可以减轻炎性疼痛。近期发现，在神经病理性痛的治疗过程中，高压氧也能起到一定的镇痛作用。但高压氧的干预方法（高压氧预处理、建模后高压氧处理等）及高压氧治疗方案（不同的压力水平、不同的处理时程等）尚未形成统一标准，其作用的分子机制如何，仍需深入探讨。外周神经损伤、胶质细胞激活、炎症反应导致的微循环障碍等原因均可导致外周和中枢神经系统敏化。HBO可能通过改善超微结构，改变脊髓不同亚型NOS的表达和活性，调节由不同亚型产生NO的水平，抑制胶质细胞的激活，早期通过减少细胞因子NO的生成，改善血液循环，减少炎症因子（TNF-β、IL-1β、IL-6）的生成，达到缓解神经病理性痛的目的。在高压氧治疗神经病理性疼痛的过程中，NOS是否起到了关键的作用，其产生与星形胶质细胞激活是否存在相关性，是否与痛敏有关，是否通过NO-cGMP-PKG信号系统而产生的镇痛作用，目前尚未见报导。
　　本课题贴近临床，通过对大鼠CCI模型早期给予2.5ATA高压氧治疗的观察，为高压氧(HBO)应用于神经病理性疼痛的治疗，寻找和发现理论依据，丰富神经病理性疼痛的治疗途径，提高治疗效果，使之成为有前景的治疗方法之一。
　　方法:
　　1.动物模型
　　健康成年雄性Sprague Dawley大鼠，体重在300±20g，参考Bennett和Xie的方法:选取大鼠左侧后肢，于后外侧行切口，在股骨后游离坐骨神经主干，用4条丝线(4-0号)做松弛结扎，丝线分别相距约1mm的间距，使神经外膜略受压，导致坐骨神经支配区域的肌肉产生暂短的收缩。而假手术组仅对大鼠进行坐骨神经的分离，不进一步做结扎。
　　2.鞘内置管
　　L3-L4棘间椎管内植入PE10导管，插管深度2cm。
　　3.高压氧处理方式
　　HBO组于CCI术后1天行高压氧治疗，连续5天，以0.125ATA/min速率缓慢加压至2.5ATA，维持高压氧状态60min，后逐渐以匀速减压恢复至常压。
　　4.实验动物分组
　　(1)实验一
　　分3组，分别为:
　　①Sham组—假手术组
　　②CCI组—构建CCI模型
　　③HBO组—CCI后1天给予2.5ATA的HBO治疗，连续5天。
　　于术前、术后0、3、7、14d进行疼痛行为学测试，观察早期给予2.5ATA高压氧对神经病理性大鼠疼痛行为学变化的影响以及电镜超微结构的影响，利用免疫组化方法进一步明确GFAP在脊髓背角分布及表达情况，了解其变化趋势。
　　(2)实验二
　　分3组，分别为:
　　①Sham组
　　②CCI组
　　③HBO组—CCI后1天给予2.5ATA的HBO治疗，连续5天。
　　于0、3、7、14d取脊髓标本，利用RT-PCR检测iNOS、nNOS、eNOS mRNA表达变化，利用Western Blot检测iNOS、nNOS蛋白表达变化，RT-PCR检测TNF-α、IL-1β的变化。
　　(3)实验三
　　将CCI大鼠进行手术，行鞘内置管，并分为7组，分别为:
　　①CCI组—空白对照组
　　②HBO组—CCI后1天给予HBO，连续5天。
　　③HBO+NS组—CCI后1天给予HBO，HBO前30min，鞘内给予10uL NS，连续5天。
　　④HBO+DMSO—CCI后1天给予HBO，HBO前30min，鞘内给予10uLDMSO，连续5天。
　　⑤HBO+L-NAME—CCI后1天给予HBO，HBO前30min，鞘内给予10uLL-NAME（100μg），连续5天。
　　⑥HBO+ODQ—CCI后1天给予HBO，HBO前30min，鞘内给予10uL(10μg)ODQ，连续5天。
　　⑦HBO+KT5823—CCI后1天给予HBO，HBO前30min，鞘内给予10uL KT5823(500ng)，连续5天。
　　给药后进行疼痛行为学测试，于第7天取大鼠脊髓标本，利用Western Blot、RT-PCR检测PKG1蛋白及mRNA表达变化。
　　结果:
　　1.早期HBO对神经病理性痛镇痛作用
　　CCI大鼠在造模后第3天，大鼠就开始出现机械性缩足阈值(MWT)降低，及热辐射潜伏期(TWL)缩短的趋势，第7天降至最低值，并一直持续至第14天。给予HBO治疗后机械性缩足阈值(MWT)明显升高，热辐射潜伏期(TWL)明显延长，提示早期给予HBO可以明显缓解神经病理性痛，即产生镇痛效应，可改善机械性痛敏及热痛敏。电镜下可观察到HBO治疗后与CCI组对比，神经细胞核膜及核仁清楚、染色质分布均匀、突触结构清楚。免疫组化在CCI大鼠中可见脊髓背角GFAP表达上调，时间并与大鼠疼痛行为学的变化一致，HBO组抑制CCI导致的GFAP表达上调。
　　2.早期HBO脊髓各亚型NOS及炎症因子的改变
　　HBO可以减少CCI大鼠脊髓iNOS和nNOS蛋白及mRNA的表达，且对nNOS的调节作用更为明显，对eNOS表达无影响。早期HBO可以减少CCI大鼠TNF-α，IL-1β的表达，IL-1β减少更为明显。
　　3.HBO的镇痛效应与NO-cGMP-PKG信号通路的激活
　　HBO前30min鞘内连续5天给予NO-cGMP-PKG信号通路的抑制剂，显著抑制了HBO改善CCI病理性大鼠的疼痛行为，使大鼠机械性痛阈明显降低及热痛阈明显缩短，并且机械性痛阈降低大于热痛阈的降低。HBO明显增加脊髓PKG1的蛋白和mRNA的表达，HBO在CCI大鼠的镇痛作用与脊髓PKG1表达增多有关。HBO在CCI大鼠的镇痛作用与NO-cGMP-PKG信号通路的激活有关。
　　结论:
　　1.早期给予2.5ATA HBO在神经病理性疼痛能够产生镇痛作用，对热痛敏及机械性痛敏均有效。
　　2.早期给予2.5ATA HBO改善神经病理性疼痛的作用，是通过减少异常突触形成，抑制脊髓星形胶质细胞活化实现的，并通过减少iNOS及nNOS的表达缓解痛敏。
　　3.早期给予2.5ATA HBO产生的镇痛效应与NO-cGMP-PKG信号通路的激活有关，使PKG1表达增加，减少下游炎症因子的释放，从而减少痛觉敏化。
　　本研究提示，NO-cGMP-PKG信号通路在HBO减轻神经病理性疼痛中，起到了重要的作用。

目录

声明

摘要

英文缩略语

前言

第一部分：早期高压氧在神经病理性痛的镇痛作用

1 前言

2．1 材料

2．2 方法

3．1 疼痛行为学观察

3．2 电镜结果

3．3 免疫组化结果

4 讨论

5 结论

第二部分：早期高压氧神经病理性痛大鼠脊髓背角各亚型一氧化氮合酶表达变化

1 前言

2．1 材料

2．2 方法

3．1 实时荧光定量结果

3．2 Western Blot结果

4 讨论

5 结论

第三部分：NO-cGMP-PKG信号传导通路参与高压氧在神经病理性痛的镇痛作用

1 前言

2．1 材料

2．2 方法

3．1 疼痛行为学观察

3．2 Western Bolt结果

3．3 实时荧光定量结果

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 神经病理性疼痛机制的研究进展

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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