紫草素对哮喘气道炎症和气道重塑的影响及其机制研究

摘要

目的:
　　本研究旨在探讨紫草素治疗对慢性哮喘模型小鼠气道炎症、气道重塑的影响及对PDGF诱导的AMSCs增殖、迁移的影响，并对其机制进行初步的探讨，为紫草素治疗哮喘提供实验依据。
　　方法:
　　一、紫草素对慢性哮喘模型小鼠气道炎症及气道重塑的影响
　　（一）慢性哮喘模型制作
　　按照BALB/c小鼠慢性哮喘模型制作方法，在实验的笫1d、8d、15d每只小鼠腹腔注射含有卵蛋白100μg、氢氧化铝凝胶1mg的致敏液共0.2ml致敏，第22d开始雾化吸入1％卵蛋白诱发小鼠喘息发作，隔日一次（每周3次），共雾化激发8周。
　　（二）分组
　　选择同体重，体重为18-20g，同周龄，年龄为4-6周的BALB/c雌性小鼠共36只，动物先于我院SPF级实验室中饲养1周，以适应周围环境，再随机分为6组进行实验。按不同的影响因素进行分别研究。其中正常对照组6只、哮喘模型组6只、紫草素低剂量组(0.5mg/kg)6只、紫草素中等剂量组(2mg/kg)6只、紫草素高剂量组(4mg/kg)6只、地塞米松治疗（阳性对照）组6只。
　　正常对照组:卵蛋白吸入改为生理盐水雾化吸入;
　　哮喘模型组:与哮喘模型制作的过程一致;
　　紫革素低剂量（0.5mg/kg）组:卵蛋白给药致敏、诱喘同哮喘模型组。致敏第22d开始，在雾化吸入卵蛋白前1小时给予每只小鼠紫草素0.5mg/kg腹腔注射;
　　紫草素中剂量(2mg/kg)组:卵蛋白给药致敏、诱喘同哮喘模型组。致敏第22d开始，在雾化吸入卵蛋白前1小时给予每只小鼠紫草素2mg/kg腹腔注射;
　　紫草素高剂量(4mg/kg)组:卵蛋白给药致敏、诱喘同哮喘模型组。致敏第22d开始，在雾化吸入卵蛋白前1小时给予每只小鼠紫草素4mg/kg腹腔注射;
　　地塞米松治疗（阳性对照）组:卵蛋白给药致敏、诱喘同哮喘模型组。致敏第22d开始，在雾化吸入卵蛋白前1小时给予每只小鼠地塞米松2mg/kg腹腔注射;
　　二、紫草素对PDGF诱导的气道平滑肌细胞增殖、迁移的影响
　　（一）细胞培养及鉴定
　　SD大鼠麻醉后左心室取血处死。分离大鼠气管，注意无菌操作，剥离气管壁外膜，用棉签于内膜处轻轻擦拭几下以去除内膜。食管与气管相连接处的气管上有一小条无软骨环的肌肉组织，此处即为气道平滑肌组织，用眼科剪将其小心剪下，含双抗的DMEM培养液清洗后将平滑肌条剪碎。用0.1％胰酶于37℃水浴震荡10min，1000r/min离心5min，去上清。后于37℃水浴下采用0.1％Ⅳ型胶原酶消化30min，1000r/min离心5min，此步骤重复2次。加入含10％胎牛血清的DMEM终止消化，轻轻吹打重悬细胞后200目滤网过滤后接种至50ml培养瓶37℃5％CO2孵箱培养。3d换液，7d长满培养瓶。用0.25％胰蛋白酶消化传代后，利用成纤维细胞贴壁较快的特点纯化平滑肌细胞，取第4代细胞用于检测。α-SMA免疫荧光法鉴定气道平滑肌细胞。
　　（二）细胞处理及分组
　　细胞毒性分析，根据MTT结果，选取对细胞毒性小的紫草素干预浓度0.3、1μM用于后续实验。
　　结果:
　　一、紫草素对慢性哮喘模型小鼠气道炎症及气道重塑的影响
　　在给予乙酰甲胆碱激发后，哮喘模型组的Penh值高于正常对照组(P＜0.05);应用不同剂量的紫草素及地塞米松干预均可使Penh值较哮喘组下降，且紫草素对Penh升高的抑制作用呈剂量依赖性(P＜0.05)，高剂量紫草素组的Penh值较低剂量紫草素下降(P＜0.05);在Mch激发浓度为3.125、6.25、12.5mg/ml时，地塞米松组对Penh的抑制作用显著高于紫草素高剂量干预组(P＜0.05)，但Mch激发浓度升高至25mg/ml、50mg/ml时，地塞米松组与紫草素高剂量组小鼠Penh值比较无统计学差异（P＞0.05）。
　　二、紫草素对PDGF诱导气道平滑肌细胞增殖、迁移的影响
　　1、紫草素对PDGF诱导的ASMCs增殖的影响:与正常ASMCs培养组相比，PDGF诱导组的ASMCs在实验的12、24、48小时细胞增殖水平显著提高(P＜0.01);在实验的24、48小时，0.3μM紫草素能有效抑制PDGF诱导的ASMCs增殖(P＜0.05)，1μM紫草素能显著抑制PDGF诱导的ASMCs增殖（P＜0.01）。
　　2、紫草素对PDGF诱导的ASMCs细胞周期变化的影响:与正常对照组相比，PDGF组ASMCs细胞处于G0/G1期的比例显著下降(P＜0.01)，而处于G2/M期的细胞比例显著升高(P＜0.01);0.3μM、1μM紫草素干预可以逆转PDGF诱导的ASMCs细胞周期改变(P＜0.01)，而1μM紫草素较0.3μM紫草素干预逆转PDGF诱导ASMCs细胞周期改变的作用更显著(P＜0.05)。
　　3、紫草素对PDGF诱导的ASMCs细胞迁移的影响:对照组ASMCs迁移数量较少，与对照组相比，PDGF诱导组细胞在实验的12、24、48小时迁移数量显著增多(P＜0.01);在实验的24、48小时，0.3μM紫草素能有效抑制PDGF诱导的ASMCs迁移(P＜0.05)，1μM紫草素能显著抑制PDGF诱导的ASMCs迁移(P＜0.01)。
　　三、紫草素抑制哮喘气道炎症及气道重塑的分子机制研究
　　1、紫草素对ERK1/2信号通路活化的影响
　　在肺组织中，哮喘模型组肺组织中的ERK磷酸化水平明显增高(P＜0.01);在细胞中，PDGF诱导组的ERK磷酸化水平明显增高（P＜0.01）。在肺组织中，给予不同浓度的紫草素、地塞米松干预后，肺组织中的ERK1/2磷酸化水平随紫草素浓度的升高而显著降低(P＜0.01)，高剂量紫草素与地塞米松干预组抑制ERK1/2磷酸化水平无差异(P＞0.05);
　　2、紫草素对NF-κB信号通路活化的影响
　　在细胞实验中，PDGF诱导组的IκBα、p-IκBα及胞浆和胞核内NF-κB p65蛋白表达变化与哮喘模型组肺组织中的蛋白表达改变趋势一致，而紫草素处理后可逆转PDGF诱导引发的IκBα、p-IκBα及胞浆和胞核内的NF-κB p65蛋白表达改变，与PDGF诱导组比较，1μM紫草素处理细胞后IκB的蛋白表达升高（P＜0.05），p-IκB的蛋白表达显著下降(P＜0.01)，而胞浆NF-κBp65蛋白表达显著升高（P＜0.01），胞核NF-κB p65蛋白表达显著减低(P＜0.01)。
　　在细胞实验中，正常对照组NF-κB主要分布于ASMCs的细胞浆中。在PDGF诱导的ASMCs中，NF-κB的亚细胞分布由细胞浆部分转移至细胞核中，而0.3μM、1μM紫草素处理能够抑制PDGF诱导的NF-κB分布转移。
　　3、紫草素与信号通路抑制剂对ASMCs增殖、迁移以及ERK1/2/NF-κB信号通路活化影响的比较
　　在细胞实验中，当单独给予紫草素、联应用紫草素和PD98059处理时，抑制ASMCs增殖、细胞周期变化及细胞迁移的作用均较单独应用PD98059处理时更显著（P＜0.01）。当单独给予紫草素、联应用紫草素和PDTC处理时，抑制ASMCs增殖、细胞周期变化及细胞迁移的作用均较单独应用PDTC处理时更显著（P＜0.05）。
　　在细胞实验中，联合应用紫草素和通路阻滞剂(PD98059或PDTC)比单独应用紫草素或通路阻滞剂（PD98059或PDTC）对抑制p-ERK1/2、p-IκBα蛋白表达及NF-κB核内移的作用更显著(P＜0.05)。
　　结论:
　　1、紫草素能够降低慢性哮喘模型小鼠的气道高反应性;
　　2、紫草素能够抑制慢性哮喘模型小鼠的气道炎症及黏液高分泌状态;
　　3、紫草素可降低哮喘小鼠BALF中IL-4、IL-5水平，推测其可能是通过抑制Th2细胞反应发挥作用。
　　4、紫草素能够减少慢性哮喘模型小鼠气道周围胶原形成，降低肺组织中羟脯氨酸含量，下调哮喘气道重塑时经典标志物α-SMA、MMP-9的表达，从而发挥抑制哮喘模型中气道重塑的作用。
　　5、紫草素能够抑制PDGF诱导的ASMCs异常增殖;
　　6、紫草素可通过对ASMCs细胞周期的调控抑制PDGF诱导的细胞异常增殖;
　　7、紫草素能够抑制PDGF诱导的ASMCs细胞迁移。
　　8、ERK1/2/NF-κB信号通路活化参与了OVA诱导的哮喘小鼠气道炎症、气道重塑，紫草素干预可能通过抑制ERK1/2/NF-κB信号通路激活，发挥抑制哮喘小鼠气道炎症及气道重塑的作用。
　　9、ERK1/2/NF-κB信号通路活化参与PDGF诱导的ASMCs增殖、迁移过程，紫草素干预可能通过抑制ERK1/2/NF-κB信号通路激活，发挥抑制ASMCs异常增殖、迁移的作用。
　　10、紫草素抑制PDGF诱导的ASMCs增殖、迁移过程中，不仅ERK1/2/NF-κB信号通路参与其中，可能还存在其他信号通路的共同介导。

目录

声明

摘要

英文缩略语

第一部分：紫草素对慢性哮喘模型小鼠气道炎症及气道重塑的影响

1 前言

2．1 实验动物

2．2 主要仪器

2．3 主要药品及试剂

2．4 主要试剂配制

2．5 实验方法

2．6 统计方法

3．1 气道反应性的测定

3．2 肺组织病理变化

3．3 BALF中的炎性细胞计数

3．4 各组小鼠的细胞因子含量

3．5 各组小鼠肺组织羟脯氨酸含量的变化

3．6 免疫组织化学法检测各组小鼠肺组织α-SMA表达

3．7 Western-blot方法检测各组肺组织中α-SMA和MMP-9的蛋白表达

4 讨论

5 结论

第二部分：紫草素对PDGF诱导的气道平滑肌细胞增殖、迁移的影响

1 前言

2．1 实验动物

2．2 主要仪器

2．3 主要药品及试剂

2．4 主要试剂配制

2．5 实验方法

2．6 统计学分析

3．1 ASMCs形态学观察

3．2 α-SMA免疫荧光染色细胞鉴定ASMCs

3．3 细胞毒性分析

3．4 紫草素对PDGF诱导的ASMCs增殖的影响

3．5 紫草素对PDGF诱导的ASMCs周期分布改变的影响

3．6 紫草素对PDGF诱导的ASMCs迁移的影响

4 讨论

5 结论

第三部分：紫草素抑制哮喘气道炎症及气道重塑的分子机制研究

1 前言

2．3 主要药品及试剂

2．4 主要试剂配制

2．5 实验方法

2．6 统计学分析

3 结果

3．1 紫草素对ERK1／2信号通路活化的影响

3．2 紫草素对NF-κB信号通路活化的影响

3．3 紫草素与信号通路抑制剂对ASMCs增殖、迁移以及ERK1／2／NF-κB信号通路活化影响的比较

4 讨论

5 结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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