辽宁省东北林蛙遗传多样性与环渤海地区林蛙系统发育研究

摘要

运用RAPD分子标记方法，对分布于辽宁省的4个东北林蛙种群的遗传多样性进行研究，以揭示辽宁省东北林蛙的遗传多样性水平、遗传变异和遗传结构，进而探讨东北林蛙种群间的遗传分化程度及其与其生境的关系，为合理利用东北林蛙资源提供科学的依据。通过对环渤海地区分布的林蛙线粒体16S rRNA基因序列分析，采用多种方法对其系统发育关系进行分析，探讨本地区林蛙动物的系统进化关系和演化机制，以期为从分子生物地理学角度探索环渤海地理形成及变化的过程提供帮助。
　　 一、从辽宁省桓仁、抚顺、本溪和阜新采集到4个自然种群的东北林蛙，通过RAPD分子标记，研究了东北林蛙的遗传多样性和遗传分化。主要分析了种群间的等位基因频率、多态条带百分率(PPL)、基因多样度(h)、基因分化系数(Gst)和Shannon多样指数等遗传参数，用非加权平均法构建系统树，并通过分子变异分析(AMOVA)来探讨遗传变异在个体、种群和地理区域等不同阶层中的分布格局。研究结果如下：
　　 (1)从23个随机引物中筛选出9个重复性好、多态性高的引物，对110个东北林蛙样本基因组DNA进行扩增，每个引物扩增出7-13个明显的片断，共检出95条带，全部表现出多态性，多态百分率100％。Shnnaon多样指数(I=0.1596)及Nei基因多样性指数(h=0.0821)均显示东北林蛙遗传变异程度比较低，遗传多样性相对缺乏。表现最为丰富的桓仁地区，Shannon多样指数也仅为0.2337，基因多样性指数为0.1341。
　　 (2)4个地理种群间基因分化系数(Gst=0.0231)较低，而群体之间每代迁移数很大(Nm=9.0219)，说明各群体间基因交流比较多，群体之间无显著遗传分化。在基因多样性测度中，群体内基因多样性(Hs=0.0753)在总基因多样性(Ht=0.0771)中所占比例为97％。分子变异分析(AMOVA)结果，遗传变异主要来自于种群内(Fst=0.1210)。
　　 二、分析了6种林蛙30个样本的线粒体16S rRNA基因序列，结合已经发表的镇海林蛙和日本林蛙的同源序列，探讨了环渤海地区林蛙群的系统发育关系和生物地理演化。用邻接法(NJ)、最大简约法(MP)、最大似然法(ML)和贝叶斯推论(BI)构建了系统发育树。以基于Hierarchical Likelihood Ratio Tests(hLRT)的GTR作为ML/BI法最佳进化模型。得出以下研究结果和结论：
　　 (1)建立在系统发育基础上，建议将黑龙江林蛙种组(费梁等，2005)的桓仁林蛙划归中国林蛙种组。
　　 (2)徂徕林蛙的6条16S rRNA基因序列共享一个单倍型，结合其成体形态和蝌蚪唇齿式的研究结果，可以为其物种有效性提供佐证。
　　 (3)根据系统发育分析并结合地质学文献描述，我们认为日本林蛙、镇海林蛙和徂徕林蛙同属一个进化支，具有共同的祖先。

目录

文摘

英文文摘

1 绪论

1.1 林蛙研究综述

1.1.1 分类地位

1.1.2 地理分布

1.1.3 生活习性

1.1.4 经济价值

1.1.5 林蛙研究进展

1.1.6 环渤海地区林蛙的生物多样性

1.2 遗传多样性和分子系统发育研究

1.2.1 概念

1.2.2 研究遗传多样性和系统发育的意义

1.2.3 遗传多样性和系统发育研究中分子标记的选择

1.2.4 遗传多样性评价和统计方法

1.2.5 分子系统发育树及其构建方法

1.3 本研究的目的和意义

2 辽宁省东北林蛙遗传多样性

2.1 实验材料

2.1.1 样本采集

2.1.2 主要仪器和设备

2.1.3 主要试剂与配制

2.2 实验方法

2.2.1 基因组DNA的提取与检测

2.2.2 RAPD试验方法

2.2.3 数据统计与分析

2.3 结果

2.3.1 基因组DNA提取结果

2.3.2 RAPD标记的遗传多态性

2.3.3 群种遗传分化

3 环渤海地区林蛙系统发生关系

3.1 样本与试剂

3.1.1 样本采集

3.1.2 主要仪器与试剂

3.2 试验方法

3.2.1 DNA提取

3.2.2 PCR扩增

3.2.3 PCR产物克隆与测序

3.2.4 数据统计与分析

3.3 结果

3.3.1 序列特征

3.3.2 遗传距离

3.3.3 系统发育关系

4 讨论

4.1 辽宁省东北林蛙遗传多样性

4.1.1 RAPD-PCR条件的优化

4.1.2 辽宁省东北林蛙的遗传多样性

4.1.3 辽宁省东北林蛙遗传分化

4.2 环渤海地区林蛙系统发生关系

4.2.1 林蛙群的系统进化关系

4.2.2 徂徕林蛙的系统位置

4.2.3 分类推断

4.2.4 林蛙群在环渤海地区的生物地理模型

参考文献

简历

致谢