商陆核糖体失活蛋白cDNA的植物表达载体构建及转化烟草的研究

摘要

以商陆核糖体失活蛋白(PAP)的cDNA序列为依据,设计并合成特异性引物,应用多聚酶链式反应(PCR)技术扩增出5'端含有BamHI,3'端含有KpnI限制性内切酶酶切位点的目的片段,且在序列的开始和结尾分别加入起始密码子ATG和终止密码子TAA.将该目的片段定向克隆于载体pROKII中与CaMV35S启动子和Nos末端构成植物表达载体pRPAP,通过菌落直接PCR法和酶切分析鉴定出阳性重组子,用直接导入法将其导入农杆菌EHA105,以此作为工程菌进行烟草转化,转化率达37％.对筛选到的阳性植株随机取样进行PCR及Southern印迹分析,结果表明,PAP基因已经整合到烟草基因组中,证明载体构建成功.抗立枯病实验表明,转基因植株与对照植株相比抗性提高.

目录

1.前 言

1.1植物抗真菌基因工程的理论依据

1.2抗真菌基因工程策略及进展

1.2.1病原真菌无毒基因与宿主抗病基因结合

1.2.2从植物或微生物中分离抗真菌蛋白基因，并导入植物体成为转基因植物

1.2.3植物保卫素

1.2.4转真菌酶抑制物基因

1.2.5降解真菌产生的毒素

1.3植物核糖体失活蛋白RIPS及其基因工程研究进展

1.3.1植物核糖体失活蛋白的主要性质、作用机理及分类

1.3.2 RIPs的功能

1.3.3商陆核糖体失活蛋白（Pokeweed Anti-viral Protein，PAP）的研究进展

1.3.4 RIPs的基因工程进展

1.4本论文的意义

2.材料和方法

2.1实验材料

2.1.1菌种和质粒

2.1.2植物材料

2.1.3测试真菌

2.1.4药品及试剂

2.1.5引物

2.2实验方法

2.2.1大肠杆菌质粒提取

2.2.2农杆菌质粒提取

2.2.3质粒的酶切及载体与目的片段的连接

2.2.4大肠杆菌(E.coli)JM109感受态细胞的制备及转化

2.2.5农杆菌感受态制备及转化

2.2.6引物设计与合成

2.2.7目的DNA片段PCR扩增

2.2.8含重组质粒菌落的鉴定

2.2.9烟草的基因转化

2.2.10 Southern blot检测

2.2.11转基因烟草的抗病性实验

3.结果与分析

3.1商陆核糖体失活蛋白基因PAP扩增

3.2选用目的片段内部限制性内切酶酶切位点，进行酶切分析，验证目的片段的正确性

3.3植物表达载体的构建及重组子鉴定

3.4双元载体向农杆菌的导入及工程菌的鉴定

3.5烟草转化牙的获得及继代筛选

3.6烟草叶片转化率分析

3.7烟草转化植株的移栽

3.8转基因烟草植株的分子鉴定

3.8.1PCR检测

3.8.2 Southern blot检测

3.9感病实验分析

4.讨论

4.1引物设计策略

4.2双元载体向根癌农杆菌的直接导入

4.3工程菌的鉴定

4.4 PCR反应体系中模板的严格性对正确鉴定阳性重组体的影响

4.5菌落直接PCR鉴定筛选重组子的技术的应用

4.6 PCR产物用于连接反应前的处理

4.7工程菌菌株对转化率的影响

4.8转化外源基因的稳定性分析

5.结 论

参考文献

致谢