两种高效的SARS病毒RNA检测方法的研究

摘要

严重急性呼吸综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS)是由一种新型冠状病毒(SARS病毒)引起的急性呼吸系统疾病.本文通过现代分子生物学实验技术手段,建立了两种独特的高效的SARS病毒RNA检测方法.竞争RT-Nested PCR方法,通过构建Internal Control RNA,使其同时具有阳性对照、内部对照、竞争性RNA的三重功能,弥补了至今普遍被应用的RT-Nested PCR方法检测SARS病毒RNA易于出现假阳性和假阴性的结果及不能对SARS病毒RNA进行定量分析的不足,大大降低了出现假阳性和假阴性的机率,同时能对SARS病毒RNA进行半定量分析.实时荧光定量one step RT-PCR方法,通过进行大量的反应体系及反应条件的探讨实验,建立了一种快速、准确、特异、灵敏的SARS病毒RNA定量检测体系.快速——时间仅需40多分钟,目前报道同类方法约需2个小时.准确——SARS病毒RNA检测用探针采用FAM标记,Internal Control RNA检测用探针采用ROX标记,结果无需电泳,在同一反应体系中两波段同时实时监控,最有效地控制假阳性、假阴性的结果.同时应用构建的SARS ControlRNA绘制的标准定量曲线,具有高度信赖的定量线性关系.特异——采用了Taq Man探针方法和Hot Start用DNA聚合酶Ex Taq HS可进行高灵敏度、高特异性地检测.灵敏——最低可检测到数拷贝的体外转录RNA分子.本研究结果表明,上述两种SARS病毒RNA检测方法都具有其独创性及优越性,具有广泛的临床应用价值,并且对基础理论研究具有重要的指导意义.

目录

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摘要

前言

1.竞争RT-Nested PCR法检测SARS病毒RNA

1.1竞争RT-Nested PCR法原理

1.1.1 RT-PCR原理

1.1.2 Nested PCR原理

1.1.3 RT-Nested PCR法原理

1.1.4竞争RT-Nested PCR法原理

1.2材料与方法

1.2.1材料

1.2.2 SARS Control RNA的构建

1.2.3 SARS Internal Control RNA构建

1.2.4竞争RT-Nested PCR法检测SARS病毒RNA

1.3实验结果

1.3.1 SARS Control RNA的构建结果

1.3.3竞争RT-Nested PCR法检测SARS病毒RNA结果

1.4讨论

1.4.1 SARS Control RNA的构建结果讨论

1.4.2 SARS Internal Control RNA的构建结果讨论

1.4.3竞争RT-Nested PCR法检测SARS病毒RNA结果讨论

2.实时荧光定量 One Step RT-PCR法检测SARS病毒RNA

2.1实时荧光定量One Step RT-PCR法原理

2.1.1实时荧光定量PCR原理

2.1.2 one step RT-PCR原理

2.1.3实时荧光定量one step RT-PCR法原理

2.2材料与方法

2.2.1材料

2.2.2 SARS Control RNA的构建

2.2.3 SARS Internal RNA的构建

2.2.4实时荧光定量PCR法检测SARS病毒RNA

2.3实验结果

2.3.1 SARS Control RNA的构建结果

2.3.3实时荧光定量PCR法检测SARS病毒RNA结果

2.4讨论

2.4.1 SARS control RNA的构建结果讨论

2.4.2 SARS Internal control RNA的构建结果讨论

2.4.3实时荧光定量one step RT-PCR法检测SARS病毒RNA结果讨论

3.SARS病毒RNA检测方法的比较

4.综述

4.1. SARS研究现状

4.1.1 SARS病毒概述

4.1.2冠状病毒的分类

4.1.3 SARS病毒的基因组

4.2.目前SARS病毒的检测手段

4.2.1分子检测方法(PCR检测)

4.2.2免疫学方法(抗体检验)

4.2.3细胞学方法(细胞培养)

4.3.目前SARS病毒研究的进展和意义

附录

参考文献

致谢