人乳铁蛋白（HLF）基因cDNA的细胞表达及精子介导转基因动物制备的研究

摘要

本研究将含有人乳铁蛋白(HLF)基因2366bp cDNA序列完整序列和800bp的奶山羊β-乳球蛋白基因51端调控序列的乳腺特异表达重组载体pLNCXHLF按常规方法提取、纯化、PCR、酶切鉴定后,用于细胞表达和精子介导转基因动物的研究.利用脂质体包裹重组质粒pLNCXHLF,导入到小鼠乳腺癌细胞株MA-782中,G418及PCR筛选获得阳性单克隆细胞.转染细胞利用海藻酸钠固定化包埋培养,同时加入激素诱导.诱导后,培养液上清通过Western-blotting分析证明,转染细胞表达并分泌出人乳铁蛋白,分子量为34KD;ELISA检测重组蛋白最高表达量为65mg/L培养基/105细胞;抗菌实验表明,所获得的重组人乳铁蛋白具有抑制大肠杆菌生长的作用,而且比人乳铁蛋白标准品作用更强.采用直接注射的方法,将脂质体包裹的含人乳铁蛋白基因的重组质粒pLNCXHLF注入兔睾丸组织和羊输精管中,进行转基因动物制备研究.所产F1代仔兔均为活体,经PCR和Southern检测,转基因阳性率相对较高(35％),而且雄体的这种能力保持的时间也很长(注射后七个月,仍可通过PCR、Southern的方法从睾丸、附睾及输精管中的精子里检测出外源基因),受精后可产生转基因兔.F1代羔羊经F1/R1系统PCR检测阳性率为33.3％(4/12),其中活体PCR阳性母羊一只.用F2/R2系统PCR检测F1代仔羊,阳性率为25％(3/12),3只均为为流产羔羊,组织解剖后提取舌,肺,肝脏,肌肉,皮肤,脑,生殖腺,脾脏,小肠,心脏,肾脏共11种组织的总DNA进行PCR检测,发现:F1/R1系统,3只羔羊肾脏中都没有外源DNA存在,而其他组织有不同程度的存在.F2/R2 PCR系统检测阳性信号较F1/R1 PCR系统少.而且各种组织的外源DNA存在的拷贝数不等,造成阳性信号的强弱程度不同.结果表明:(1)脂质体包裹外源基因转染精子的方法,可将外源基因导入受精卵中,能够获得转基因动物,并得到了较高的转基因阳性率;(2)精子携带的外源DNA的整合过程是随机的,在受精过程和胚胎早期分化过程中可能发生了片段丢失、不完全整合或游离于基因组存在而产生嵌合体.本文的研究结果证明了该方法是一种简捷有效的新途径,为进一步深入探讨精子介导的转基因动物制备可行性奠定了基础,为利用精子载体法制备转基因哺乳动物研究提供了有价值的参考.

目录

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缩略语

前言

1表达载体pLNCXHLF提取与纯化鉴定

1.1.材料与方法

1.2.实验结果

1.3.讨论

2人乳铁蛋白基因cDNA的细胞表达

2.1.材料

2.2.方法

2.3.结果

2.4.讨论

2.5.小结

3精子载体制备转基因动物的研究

3.1.材料及主要试剂

3.2.实验方法

3.3.结果

3.4.讨论

3.5.小结

参考文献

4综述

4.1乳铁蛋白的研究近况

4.2.乳腺生物反应器的研究进展

4.3.转基因动物的研究

4.4转线粒体（基因）动物

4.5.外源基因导入常用的载体

参考文献

致谢

硕士在读期间文章发表情况