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人乳铁蛋白基因克隆、表达及转基因动物制备

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目录

文摘

英文文摘

第一章前言

一研究背景

二选题依据及目的意义

三实验技术路线

第二章文献综述

一乳铁蛋白研究现状

(一)分布及含量

(二)结构及特性

(三)乳铁蛋白的代谢

(四)生物学功能

(五)乳铁蛋白基因

(六)重组人乳铁蛋白

(七)乳铁蛋白应用展望

二乳腺生物反应器研究进展

(一)乳腺生物反应器优势及存在的问题

(二)乳腺生物反应器的表达构件

(三)乳腺生物反应器研究状况

三转基因动物研究

(一)转基因动物开发价值比较

(二)转基因动物制备方法

(三)外源基因载体

四转基因动物研究中存在的问题

参考文献

第三章人乳铁蛋白基因克隆及载体构建

一材料与试剂

二实验方法

1山羊β-乳球蛋白基因5’端调控序列的克隆

2人乳铁蛋白cDNA克隆

3载体构建

三结果与分析

四讨论

五小结

参考文献

第四章人乳铁蛋白cDNA的细胞表达

一材料及试剂

二实验方法

1 G418细胞毒性的检测

2激素诱导条件的选择

3细胞转染及筛选

4转染细胞的PCR检测

5转染细胞的固定化培养

6转染细胞诱导表达及样品处理

7诱导产物检测

8重组人乳铁蛋白分析

三结果与分析

四讨论

五小结

参考文献

第五章转人乳铁蛋白基因小鼠制备及外源基因表达

一材料及主要试剂

二实验方法

1质粒注入

2子鼠PCR检测

3子鼠Southern检测

4乳汁Dot-ELISA检测

5乳汁Western blotting检测

6 ELI SA法测定乳汁中重组蛋白含量

三结果与分析

四讨论

五小结

参考文献

第六章转基因兔及羊的制备

一材料及主要试剂

二实验方法

1睾丸组织注射法

2输精管内成熟精子转染法

三结果与分析

四讨论

五小结

参考文献

第七章结论与展望

一主要结论

二本论文的创新之处

三有待于进一步开展的工作

四展望

缩略语

附录

攻读博士学位期间完成的论文情况

个人简历

致谢

大连理工大学学位论文版权使用授权书

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摘要

乳铁蛋白也称乳转铁蛋白,是乳汁中主要的铁结合蛋白,广泛分布于多种组织、细胞内,具有非特异性免疫、参与铁代谢和细胞生长调节等功能.该文克隆了人乳铁蛋白cDNA,构建了乳腺特异表达载体,在小鼠乳腺癌细胞和个体内进行了表达,并利用精子载体法尝试了转基因兔、转基因羊的制备.首先利用RT-PCR方法从人乳腺组织中扩增出乳铁蛋白cDNA序列;PCR扩增了800bp的山羊β-乳球蛋白基因5'端调控序列.通过同源序列-PCR扩增方法连接得到的片段,酶切后克隆到表达载体中,获得人乳铁蛋白基因乳腺特异表达载体pLNCXHLF.脂质体包裹pLNCXHLF,转染小鼠乳腺癌细胞MA-782,通过G418、PCR筛选获得阳性单克隆细胞.质脂体包裹重组质粒注入到小鼠睾丸中,与正常母鼠交配产生的后代,经PCR、Southern检测,部分子鼠含有外源基因.阳性母鼠产子后,乳汁中含人乳铁蛋白,与天然蛋白具有相同的迁移率,含量为4.8~6.7g/L.重组质粒经质脂体包裹,注入到兔和羊的睾丸或输精管中,后代PCR、Southern检测表明,部分个体含有外源基因.睾丸注射兔产生转染精子时间较长,注射后七个月的附睾精子仍可检测到外源基因.输精管注射得到3只流产羊,外源基因在¨种组织中分布不同,表明得到的个体为转基因嵌合体.

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