CFTR氯离子通道激活剂的筛选及其分子药理学机制研究

摘要

囊性纤维化跨膜电导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator，CFTR)是一种cAMP/PKA依赖的上皮氯离子通道，同时又是某些膜转运蛋白的调节因子。属于ATP结合盒(ATP binding cassette，ABC)转运蛋白超家族的成员。CFTR在哺乳动物中所有与分泌和吸收有关的上皮组织(例如小肠、气道、胰腺、汗腺、输精管细胞、心肌细胞、血管平滑肌细胞)中广泛表达。CFTR的主要功能是介导跨上皮细胞Cl-转运、控制氨敏感的上皮细胞Na+通道(epithelial Na+ channel，ENaC)、促进HCO3-分泌及调节K+通道等，因此CFTR与多种生理和病理状态密切相关。CFTR功能障碍会引起致死性遗传疾病囊性纤维化病(cystic fibrosis，CF)、特发性慢性胰腺炎(idiopathic chronic pancreatiti，ICP)、干眼病(keratoconjunctivitis sicca，KCS)、习惯性便秘(habitual constipation)等；而霍乱毒素和耐热性致病性大肠杆菌内毒素导致的分泌型腹泻(secretary diarrhea)、多囊肾病(polycystic kidney)等则是CFTR活动过强引起的。因此寻找能够调节野生型和突变型CFTR功能的小分子调节剂的工作近年来受到了广泛重视并取得了较大进展，目前仍是CFTR有关研究的重要目标之一。
　　 我们利用含△F508-CFTR(或wt-CFTR)的表达质粒与一种对卤族元素碘离子高度敏感的荧光绿蛋白突变体EYFP-H148Q的表达质粒共转染Fischer大鼠甲状腺上皮细胞，得到稳定表达该蛋白的两种细胞系(FRT/△F508-CFTR/EYFP-H148Q和FRT/wt-CFTR/EYFP-H148Q-I152L)。以此为筛选模型对49种生物碱类化合物和20种挥发油类化合物进行筛选，目的是为了筛选出wt-CFTR氯离子通道激活剂和△F508-CFTR氯离子通道激活剂及蛋白质质膜转运障碍纠正剂，并对其分子药理学特征进行系统研究。我们得到了8种生物碱类化合物和6种挥发油类化合物对wt-CFTR均具有明显的激活作用。由于前期本实验室已对生物碱中有明显活性的菏叶碱和白鲜碱有系统的研究，因此我们对其余六种生物碱类化合物进行进一步的研究分析，同时我们也分析了挥发油类化合物中活性最强的对羟基苯甲酸丁酯。结果表明，六种生物碱类化合物和对羟基苯甲酸丁酯对野生型CFTR Cl-通道具有明显的激活作用，其中盐酸罂粟碱、尼莫地平、对羟基苯甲酸丁酯对△F508突变型通道开放障碍也有明显的激活作用，同时胡椒碱也表现出了一定的活性。此外，六种生物碱类化合物和对羟基苯甲酸丁酯对G551D突变型CFTR Cl-通道都无激活作用，也不能纠正△F508-CFTR蛋白胞内转运的障碍。上述七种单体化合物对野生型和突变型CFTR Cl-通道的激活作用具有作用迅速、可逆、剂量依赖的特点，初步机制分析结果表明它们可能是通过与CFTR直接结合而发挥作用的。
　　 本研究中七种单体化合物对CFTR Cl-通道具有激活作用不仅为阐明CFTR的结构与功能之间的关系，以及作为先导化合物开发探索治疗与CFTR突变有关疾病等方面具有重要用途，而且为进一步明确这七种化合物其它方面的药理机制奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章引言

1.1 CFTR概述

1.1.1 CFTR的结构与表达

1.1.2 CFTR的功能与调节

1.2 CFTR与囊性纤维化

1.2.1 CFTR与肠道液体分泌

1.2.2 CFTR与胆汁分泌

1.2.3 CFTR与肺部感染及炎症

1.2.4 CFIR与多囊肾病

1.2.5 CFTR与生殖

1.2.6 CFTR与胰腺

1.3生物碱类化合物和挥发油中相关单体化合物药理作用概述

1.3.1生物碱类化合物的药理作用

1.3.2挥发油类化合物中对羟基苯甲酸丁酯的药理作用

1.4本研究的目的意义

第二章材料和方法

2.1材料

2.1.1细胞

2.1.2单体化合物

2.1.3主要试剂

2.1.4主要设备

2.2方法

2.2.1 CFTR氯离子通道荧光测定细胞模型的建立

2.2.2荧光检测的原理

2.2.3氯离子通道荧光测定方法

2.2.4 CFTR激活特异性分析

2.2.5数据统计分析

第三章结果和分析

3.1生物碱类化合物对wt-CFTR氯离子通道作用分子药理学研究

3.1.1生物碱化合物对wt-CFTR氯离子通道初筛结果

3.1.2生物碱类化合物激活CFTR氯离子通道特异性分析

3.1.3生物碱类化合物激活CFTR氯离子通道作用机制分析

3.2生物碱类化合物对突变型CFTR氯离子通道的激活作用

3.2.1对△F508-CFTR Cl-通道开放障碍的激活作用

3.2.2不能促进G551D-CFTR Cl-通道开放

3.2.3不能纠正△F508-CFTR上膜转运障碍

3.3对羟基苯甲酸丁酯对野生型和突变型CFTR Cl-通道激活作用分析结果

3.3.1对羟基苯甲酸丁酯作用于突变型CFTR Cl-离子通道

3.3.2对羟基苯甲酸丁酯促进wt-CFTR氯离子通道开放

3.3.3对羟基苯甲酸丁酯激活CFTR Cl-通道的作用机制研究

3.3.4对羟基苯甲酸丁酯激活CFTR Cl-通道的动力学和可逆性分析结果

第四章讨论

4.1生物碱类化合物对CFTR氯离子通道激活作用的分子药理学机制

4.2对羟基苯甲酸丁酯对CFTR氯离子通道激活作用的分子药理学机制

第五章结论

主要创新点

参考文献

致谢

作者简历