新型雌激素受体alpha36低表达对PC12细胞增殖和凋亡的影响及机制

摘要

雌激素受体(ER)在中枢神经系统中分布广泛,与雌激素作用后,不仅具有改善记忆和神经保护的作用,还能够介导抗炎、抗氧化等多方面功能。ERα36是一种新型雌激素受体亚型,前期工作表明其在中枢神经系统中分布广泛,但其类固醇信号转导(MISS)机制不详。大鼠PC12嗜铬细胞瘤细胞株具有多巴胺摄取系统,常作为多巴胺能神经细胞模型。本文主要以PC12高分化细胞为材料,研究ERα36低表达对神经细胞增殖和MPP+诱导的凋亡的影响,旨在探讨ERα36介导的雌激素信号通路在神经细胞生长和凋亡中的作用,为进一步阐明动物雌激素中枢作用的信号转导机制提供理论依据。
　　 本研究首先用western blot和免疫组化观察了ERα36蛋白在PC12细胞、原代培养的海马神经元的表达:然后,利用ERα36-shRNA干扰质粒转染PC12细胞,通过筛选建立了ERα36低表达细胞模型PC12-36L1；采用流式细胞术检测了细胞周期的改变,同时进一步观察了细胞增殖相关蛋白PCNA及细胞周期蛋白cyclinD1的表达；随后,通过MTT和流式细胞仪检测MPP+诱导的细胞凋亡,研究了细胞内AKT和P38等凋亡通路相关蛋白的活性,探讨了ERα36低表达对MPP+诱导的细胞凋亡的影响。
　　 得到如下结果:
　　 (1)海马神经元和PC12细胞中均ERα36反应阳性颗粒,海马神经元的ERα36主要在表达在细胞核；PC12细胞的ERα36主要表达在细胞核和核周部分。Western blot证实其分子量为36kD。
　　 (2)成功建立ERα36低表达的细胞模型PC12-36L1,其ERα36的表达水平约为正常PC12高分化细胞的一半。在PC12-36L1细胞株中,PCNA、cyclinD1等增殖生长相关蛋白表达增加,细胞S期缩短,倍增时间明显减少,生长增殖加快。
　　 (3)MPP+作用48小时后,两种细胞均发生凋亡,凋亡凋亡相关信号蛋白AKT磷酸化减弱,P38磷酸化增强。值得注意的是,两种细胞发生凋亡的程度不同,PC12-36L1细胞存活率明显高于其母细胞,抗凋亡通路相关的p-AKT表达高于PC12高分化细胞,而介导细胞发生凋亡的p-P38含量低于PC12高分化细胞。提示,ERα36低表达抵抗细胞凋亡的能力高于对照细胞。
　　 结论:大鼠海马神经元和PC12细胞均有ERα36的表达,ERα36低表达能促进PC12细胞增殖,降低MPP+诱导的PC12细胞凋亡。

目录

文摘

英文文摘

引言

1 文献综述

1.1 雌激素受体及其信号通路

1.1.1 雌激素受体分类

1.1.2 雌激素受体信号通路

1.2 雌激素受体与中枢神经系统

1.2.1 雌激素受体在中枢神经系统的表达及分布

1.2.2 雌激素与突触可塑性及学习记忆

1.2.3 雌激素的神经保护作用

1.3 展望

2 ERα36在原代海马神经元及PC12细胞中的表达

2.1 材料与方法

2.1.1 材料与试剂

2.1.2 实验方法

2.2 实验结果

2.2.1 原代培养的海马神经元形态观察

2.2.2 ERα36在原代海马神经元及PC12细胞中的表达

2.3 讨论

2.4 小结

3 ERα36低表达在PC12细胞增殖中的作用

3.1 材料和方法

3.1.1 材料与仪器

3.1.2 方法

3.2 结果

3.2.1 ERα36-shRNA质粒的扩增和鉴定

3.2.2 ERα36低表达细胞模型的建立

3.2.3 ERα36低表达对PC12细胞增殖的影响

3.2.4 ERα36低表达对PC12细胞周期的影响

3.2.5 ERα36低表达对PC12细胞生长相关蛋白表达的影响

3.3 讨论

3.4 小结

4 ERα36在MPP+诱导的PC12细胞凋亡中的作用及机制

4.1 材料和方法

4.1.1 材料与仪器

4.1.2 方法

4.2 结果

4.2.1 MPP+对PC12-36L1细胞存活率的影响

4.2.2 E2预保护对MPP+作用PC12-36L1细胞存活率的影响

4.2.3 ERα36低表达对MPP+诱导PC12细胞凋亡相关蛋白AKT和P38磷酸化水平的影响

4.2.4 ERα36低表达对MPP+诱导的PC12细胞转录因子NF-κB激活的影响

4.3 讨论

4.4 小结

结论

参考文献:

附录 A缩略词

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢