日本七鳃鳗Vav3基因克隆、表达及多克隆抗体制备研究

摘要

Vav3是在生物体内广泛表达的一种Rho家族GTPase的鸟嘌呤核苷酸转移因子，在进化上高度保守，能够通过调节Rho家族不同成员的活性参与多条T、B细胞信号通路的调控，并在细胞增殖、分化和免疫功能的调节方面发挥重要作用。七鳃鳗作为现存最古老的无颌类脊椎动物，拥有其独特的适应性免疫系统，是研究脊椎动物适应性免疫系统起源与进化的模式生物。目前，对于Vav3的研究大多集中于高等脊椎动物，七鳃鳗中是否存在Vav3尚不清楚。本论文运用生物信息学和分子生物学方法，从日本七鳃鳗白细胞cDNA文库中搜索到一条能够表达Vav3的EST序列。对其进行基因克隆、表达及生物信息学分析，有助于阐明脊椎动物Vav3基因的起源与进化。抗体的制备为进一步研究七鳃鳗适应性免疫机制及脊椎动物适应性免疫系统的起源提供了材料。
　　 本研究通过对本实验室构建的日本七鳃鳗白细胞cDNA3，000多条有效EST序列进行生物信息学分析，筛选得到能够翻译Vav3的核苷酸序列。通过RACE方法成功获得cDNA全长序列，共2，866 bp，其中编码区2，511 bp，编码837个氨基酸，理论分子量92.07 kD。通过一级序列分析、比对和高级结构预测，表明七鳃鳗Vav3具有典型的3个酪氨酸磷酸化位点，与其他物种具有较高的同源性。为了进一步阐明七鳃鳗Vav3与其他脊椎动物Vav3的亲缘关系，通过邻接法构建系统发育树，发现七鳃鳗Vav3进化地位比较低，符合生物由低等到高等的客观自然进化规律。
　　 利用基因工程手段，以GAPDH基因作为内参，设计特异性引物，Real-time PCR法检测Vav3基因在七鳃鳗心脏、白细胞、肝脏、肠、鳃、肾脏和脂肪小体中的相对表达量。发现Vav3在各个组织中广泛表达，进一步经脂多糖(LPS)刺激后，发现其在脂肪小体、鳃和白细胞中的表达量显著上调。以上结果说明，七鳃鳗Vav3参与类淋巴细胞免疫应答，在对病原菌的防御反应中也发挥重要作用。
　　 进一步构建pET-32a-Vav3原核表达载体，并在E.coli BL21中进行表达，得到可溶性表达的重组蛋白。组氨酸亲和层析柱纯化，获得七鳃鳗Vav3重组蛋白纯品。以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰兔，制备兔抗七鳃鳗Vav3多克隆抗体。流式细胞术检测七鳃鳗Vav3在白细胞中的表达量，结果显示 Vav3能够在白细胞中表达，进一步证明Vav3在七鳃鳗免疫应答中发挥重要作用。
　　 综上所述，Vav3蛋白能够在无颌类脊椎动物中表达。对其功能的推测为无颌类脊椎动物适应性免疫应答机制及脊椎动物适应性免疫应答的起源提供了重要线索。