日本七鳃鳗Vav3分子的克隆、重组表达、抗体制备以及相关免疫学研究

摘要

Vav家族蛋白最主要的功能是它们可以作为Rho/ Rac蛋白的鸟嘌呤核苷酸交换因子起调节作用。Vav鸟嘌呤核苷酸交换因子3（Vav3），Vav家族的第三个成员，广泛表达在各个组织中，在脊椎动物中调节多种细胞信号转导通路，其中包括T、B细胞受体介导的Rho家族成员的信号转导过程。目前对Vav3的研究更多的集中于高等脊椎动物，而对无颌类脊椎动物是否存在Vav3及其功能研究尚无报道。由于七鳃鳗是一种重要的低等无颌类脊椎动物的代表，因此本文主要通过克隆日本七鳃鳗Vav3基因进而进行原核细胞表达、抗体制备，为更深入了解Vav3基因在七鳃鳗免疫调节过程中的作用奠定基础。
　　日本七鳃鳗Vav3分子(Lja-Vav3)开放阅读框的长度为2568bp，编码含有855个氨基酸残基的蛋白质。Lja-Vav3含有典型的Vav家族蛋白8个保守结构域，通过对26条Vav3和Vav2的蛋白质序列进行比对分析，Lja-Vav3与有颌类脊椎动物Vav3分子的序列一致性（大约53%）比与有颌类及无颌类脊椎动物Vav2分子（大约51%）的序列一致性更高。为更深入的明了其进化关系，采用了构建进化树的方法和保守基序排布模式分析的方法进行了分析。结果显示，Vav3和Vav2这两种分子的8个保守结构域中最显著的差异体现在它们的SH3结构域。由此推测，Vav3和Vav2起源于一个共同的祖先基因的基因复制过程，并可能通过各自所作用底物的特异性选择分化而来。
　　为了更好地了解Vav3在免疫调节中的作用，我们制备了七鳃鳗Vav3兔源多克隆抗体。首先构建了Vav3-pET32a(+)重组质粒，将重组质粒导入E.Coli BL21表达菌诱导蛋白表达并进行了纯化，以纯化后的Vav3蛋白做为抗原免疫刺激新西兰兔制备抗体，采用颈动脉取血的方式将抗血清分离并纯化，得到了特异性较好的兔抗Lja-Vav3多克隆抗体。使用实时定量PCR和Western blot实验分别检测Lja-Vav3在基因转录水平和在蛋白水平的表达，结果表明，Lja-Vav3在白细胞和髓样小体组织中其mRNA水平和蛋白水平在免疫刺激后显著增加。另外，Lja-Vav3的表达水平在受到LPS的刺激后上调显著，而在PHA刺激后无明显变化。这些结果证明，Lja-Vav3可能参与了七鳃鳗VLRB+淋巴细胞（类B细胞）的免疫应答过程，我们的研究结果为进一步研究Vav3分子在七鳃鳗淋巴细胞免疫应答过程中的作用奠定了基础。

目录

声明

第1章引言

1.1 Vav3的结构特点

1.2 Vav3在淋巴细胞免疫应答反应中的作用

1.3 Vav3在体内生理生化功能

1.4 Vav3在肿瘤疾病中的研究

1.5 小结

第2章日本七鳃鳗Vav3分子的克隆以及生物信息学分析

2.1 七鳃鳗Vav3基因的分子克隆

2.2 七鳃鳗Vav3基因序列生物信息学分析

2.3 讨论

2.4 小结

第3章七鳃鳗Vav3基因原核表达与蛋白纯化

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

第4章 七鳃鳗Vav3多克隆抗体的制备及鉴定

4.1 材料和方法

4.2 结果

4.3讨论

4.4小结

第5章七鳃鳗Vav3蛋白相关免疫学研究

5.1 Real-Time PCR检测Vav3的表达

5.2 Western blot检测

5.3讨论

5.4小结

结论

本文创新点

参考文献

附录 A稀释倍数标准曲线

附录B pET-32a(+)质粒图谱

附录C蛋白浓度测定标准曲线

附录D 日本七鳃鳗Vav3氨基酸序列

致谢