重组日本七鳃鳗rLj-RGD2与其4种突变体蛋白对Lewis细胞生物活性的比较

摘要

Lj-RGD2含有两个RGD模体，分子质量为8kD，是来自于日本七鳃鳗口腔腺分泌蛋白，具有典型RGD毒素蛋白的特征。为了研究Lj-RGD2的结构与其功能具有怎样的关系，本文采用基因突变的方法，对野生型Lj-RGD2进行基因突变，即对其具有功能的RGD模体进行缺失突变，因为Lj-RGD2基因的重复序列较多，无法执行定点突变，故合成其突变体的全基因序列，以pET23b作为其突变体的载体，用CaCl2转化法转入表达菌E.coil BL21中。Lj-RGD2的突变体包括：缺失第一个RGD基因，保留第二个RGD基因的突变体Lj-738；缺失第二个RGD基因，保留第一个RGD基因的突变体Lj-739；缺失两个RGD基因的突变体Lj-740；将两个RGD基因全部突变为KGD基因的突变体Lj-741。本课题对野生型和突变后的4个突变体类型进行了部分生物学活性的比较，从而确定其结构与功能的关系。具体流程为：载有突变体全序列基因的pET23b转化到表达菌E.coil BL21中，IPTG诱导带有目的基因的表达菌表达目的蛋白，经组氨酸亲和层析获得纯化的可溶性目的蛋白。获得的可溶性目的蛋白，分别作用于Lewis细胞，从而鉴定他们的生物学活性。细胞增殖实验(MTT法)结果表明，rLj-RGD2和其4个突变体蛋白均以剂量依赖方式抑制bFGF诱导的Lewis细胞的增殖rLj-RGD2、rLj-738、rLj-739、rLj-740、rLj-741的IC50值分别为1.12μmol/L、1.23μmol/L、1.11μmol/L、1.18μmol/L、1.03μmol/L；通过Transwell细胞培养板检测rLj-RGD2及其4种突变体蛋白对由bFGF诱导的Lewis细胞迁移的抑制作用，其结果表明，rLj-RGD2及其4种突变体蛋白rLj-738、rLj-739、rLj-740、rLj-741均能抑制Lewis细胞的迁移，抑制率分别为30％、31％、31％、34％、25％；将人工基质膜Matrigel固定到Transwell培养板的多聚碳酸盐膜上以模仿体内环境，从而研究rLj-RGD2与4种突变体蛋白对Lewis细胞浸润的抑制作用，结果显示，rLj-RGD2及其4种突变体蛋白均能抑制由bFGF诱导的Lewis细胞穿透Matrigel的浸润行为，抑制率为22％、24％、32％、32％、24％；rLj-RGD2及其4种突变体蛋白对Lewis细胞骨架均有破坏作用；rLj-RGD2及其4种突变体蛋白均能诱导Lewis细胞的凋亡；对rLj-RGD2及其4种突变体蛋白作用于Lewis细胞的作用机理进行了初步的研究，结果表明rLj-RGD2及其4种突变体蛋白都能下调。FAK、ILK表达及FAK磷酸化水平。上述结果表明，rLj-RGD2抗Lewis肿瘤细胞的功能既与RGD模体也与富组氨酸结构相关，其中涉及的作用机制可能并不相同。