辽宁绒山羊蛋白脂质蛋白质基因(PLP2)的表达研究

摘要

辽宁绒山羊是我国特有的禁止基因外流的宝贵遗传资源，产绒量居全国第一。在前期工作中，我们通过建库及Primer walking质粒测通的方法克隆筛选出蛋白脂质蛋白质基因(proteolipid protein2，PLP2)的全长序列。为了探究该基因的功能，我们对其进行了生物信息学分析（包括预测其开放阅读框，亲疏水性分析、跨膜预测分析、信号肽预测分析、磷酸化位点预测分析、二级结构预测、进化树的构建、多重序列的比对、保守结构域搜索），Real-time PCR，RT-PCR，原位杂交以及Noggin基因干扰慢病毒感染后目的基因的qPCR检测等的一系列分析研究。
　　分析结果显示:首先，通过生物信息学分析，我们发现PLP2基因能够编码含有152个氨基酸的蛋白质，二级结构预测显示，PLP2基因含有α螺旋结构(46.05％)、延伸结构(12.5％)和无规卷曲结构(41.45％)，功能位点分析显示，PLP2含有MARVEL结构域并且存在4个跨膜区，不存在信号肽，PLP2氨基酸含有3个Ser、2个Tyr和1个Thr可能成为蛋白激酶磷酸化位点;其次，通过RT-PCR检测显示，PLP2基因在皮肤、心脏、肝脏、肾脏、肺、脾脏中均有表达，且表达差异不是很明显，其中皮肤中的表达含量相对较高;同时，还运用了荧光定量PCR技术，定量的检测其在不同时期的表达情况，发现在兴盛期时，PLP2基因在次级毛囊的表达量约为初级毛囊的1.02倍(0.01＜P＜0.05)，在退行期时，PLP2基因的表达量仍是次级毛囊高于初级毛囊，是初级毛囊的1.16倍(0.01＜P＜0.05);另外，经过原位杂交分析，发现PLP2基因在内根鞘有表达，而在外根鞘、毛干（角质层、皮层和髓层）以及毛囊乳突中无表达;最后，通过Noggin基因干扰后PLP2基因的qPCR检测，显示空白组的表达量是NC阴性对照的1.15倍，而noggin干扰后PLP2的表达量是NC阴性对照组的0.64倍。
　　结论:(1) PLP2基因在皮肤、心脏、肝脏、肾脏、肺、脾脏各个组织中都有表达，这说明PLP2与各脏器相关功能无直接联系;(2) PLP2基因在兴盛期和退行期中的表达量均是次级毛囊高于初级毛囊，这说明PLP2基因对绒毛细度有一定的调节作用;(3)PLP2基因仅在内根鞘中有所表达，推测PLP2基因可能和绒毛脱落有关。(4) noggin基因干扰后，PLP2的表达量下降，这说明PLP2基因连同noggin基因等其他通路中的抑制基因一起，可能会对BMP通路有一定的影响，进而影响毛囊的发育。

目录

声明

摘要

1 背景概述

1．1 辽宁绒山羊

1．2 BMP及BMP信号通路

1．3 PLP基因和PLP2基因及其研究进展

1．4 研究的目的及意义

2 PLP2基因的序列分析

2．1 PLP2全长序列测定

2．1．1 primer walking测序方法

2．1．2 结果

2．2 PLP2生物信息学分析

2．2．1 方法

2．2．2 结果

2．2．3 讨论

3 PLP2基因在辽宁绒山羊毛囊不同生长时期的表达研究

3．1 实验材料

3．2 试剂及仪器

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验仪器

3．3 方法

3．3．1 初、次级毛囊的分离

3．3．2 初、次级毛囊总RNA提取

3．3．3 总RNA的检测

3．3．4 反转录PCR反应

3．3．5 半定量RT-PCR检测

3．3．6 荧光定量PCR反应

3．3．7 原位杂交

3．4 实验结果

3．4．1 RNA提取

3．4．2 RT-PCR

3．4．3 实时荧光定量PCR实验结果

3．4．4 原位杂交实验结果

3．5 讨论

4 Noggin基因干扰后PLP2基因的表达检测

4．1 实验材料及主要实验仪器

4．1．1 实验材料

4．1．2 主要实验仪器

4．2 实验步骤

4．2．1 细胞培养

4．2．2 Noggin基因干扰病毒及阴性对照腺病毒感染目的细胞

4．2．3 总RNA的抽提

4．2．4 RNA反转录成cDNA

4．2．5 qPCR引物设计

4．2．6 qPCR实验

4．3 实验结果

4．3．1 病毒感染前后细胞图片

4．3．2 预实验qPCR产物电泳图

4．3．3 正式实验qPCR产物电泳图

4．3．4 qPCR数据分析

4．4 讨论

结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢