选择性CFTR氯离子通道天然小分子抑制剂发现及其在上皮液体分泌研究中的应用

摘要

目的：
　　囊性纤维化跨膜电导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator，CFTR)是一种在上皮细胞顶膜中表达的氯离子通道，在调节离子和水分的跨膜运输，尤其是分泌型腹泻的治疗方面具有至关重要的作用。本研究的目的是自中国传统中药中筛选具有CFTR氯离子通道抑制作用的天然活性小分子化合物，以及通过药理学研究解释传统中药的抗泻机制，以期为抗泻药物的研发提供理论基础和事实依据。
　　方法：
　　1.CFTR氯离子通道功能测定模型:本研究利用成熟的CFTR功能测定细胞模型（荧光淬灭模型）进行抑制剂的初步筛选和CFTR氯离子通道的活性分析。该模型是2001年由Galietta等人设计的，用于CFTR抑制剂和激活剂的高通量筛选。我们利用小鼠/人CFTR和荧光绿蛋白突变体EYFP(YFP-H148Q)表达质粒稳定共转染Fischer大鼠甲状腺上皮细胞(FRT)，建立氯离子通道功能测定模型。
　　2.CFTR抑制剂的高通量筛选和活性引导下的化合物分离解析:利用荧光淬灭模型对实验室先前建立的中药样品组分库的40，000种组分实施高通量筛选。对于获得的活性组分，在活性引导下通过有机溶剂抽提、萃取、柱层析和制备型高效液相色谱(Prep-HPLC)等方法分离得到活性单体化合物，并通过分析型高效液相色谱(Anal-HPLC)、质谱(MS)和核磁共振(NMR)等技术对活性化合物的结构进行解析。
　　3.细胞水平上的药理学活性的分析方法:利用荧光淬灭模型对获得的CFTR抑制剂进行必要的药理学活性分析，其中包括量-效关系、时间动力学、可逆性等。
　　4.离体组织水平上的药理学活性分析:利用尤斯灌流室(Using chamber)电压钳系统研究活性化合物对小鼠回肠粘膜以及大鼠结肠粘膜CFTR介导的短路电流的影响。
　　5.活体水平上的药理学活性研究:利用小鼠肠道闭环(Closed-loop)实验测定中药活性组分对霍乱毒素诱导的小鼠肠道液体分泌的抑制作用。
　　结果：
　　1.利用CFTR氯离子通道功能测定细胞模型，从提取自五百种中草药的40，000种中药组分中分离到3种中药的活性组分，其中包括冬凌草提取物的连续的8个活性组分、槟榔提取物的连续的7个活性组分以及公丁香提取物的连续的8个活性组分。
　　2.在活性引导下，采取多种分离提取技术对冬凌草、槟榔和公丁香中的活性成分进行分离。从冬凌草中分离获得的小分子单体化合物、公丁香的乙酸乙酯提取物和槟榔的水提物中检测到CFTR氯离子通道抑制活性，并通过分析型高效液相色谱对活性化合物进行监测。
　　3.通过分析型高效液相色谱、质谱和核磁共振技术对从冬凌草中提取的活性小分子单体化合物进行结构解析，经对比鉴定该活性化合物为冬凌草甲素。
　　4.细胞水平实验对冬凌草甲素、公丁香乙酸乙酯提取物和槟榔水提物的CFTR氯离子通道抑制活性进行分析，结果显示上述化合物/组分均能以剂量依赖的方式抑制CFTR氯离子通道活性，IC50值分别为46.8μM、42.5 mg/L和52mg/L;冬凌草甲素和公丁香乙酸乙酯提取物对CFTR氯离子通道的抑制作用具有可逆性;公丁香乙酸乙酯提取物和槟榔水提物能够显著抑制多种激活剂对CFTR氯离子通道的激活作用。
　　5.离体组织水平实验结果显示，冬凌草甲素、公丁香乙酸乙酯提取物和槟榔水提物对跨大鼠结肠粘膜和小鼠回肠的CFTR氯离子通道介导的短路电流具有显著的抑制作用。上述化合物/活性组分对跨大鼠结肠粘膜的Cl-转运的抑制活性的IC50值分别为:62μM、59.7 mg/L和93 mg/L;小鼠回肠的实验结果显示，三种活性化合物/活性组分浓度分别为50μM、50 mg/L和50 mg/L时，即可对CFTR氯离子通道介导的短路电流起到四成左右显著的抑制作用。
　　6.通过小鼠肠道闭环实验对冬凌草甲素、公丁香乙酸乙酯提取物和槟榔水提物对小鼠肠道液体分泌速度的抑制作用进行分析，结果表明上述冬凌草甲素(3.644μg)、公丁香乙酸乙酯提取物(10μg)和槟榔水提物(10μg)都能在6小时的时间内有效抑制霍乱毒素介导的肠道液体分泌。
　　结论：
　　本研究通过高通量筛选发现冬凌草中具有CFTR氯离子通道抑制活性的成分，在活性引导下分离提取的活性单体化合物——冬凌草甲素是CFTR氯离子通道天然的小分子抑制剂;首次阐述了传统止泻中药——公丁香的抗泻机制，是通过阻断CFTR氯离子通道来抑制腹泻引起的肠道电解质紊乱和体液流失;发现槟榔对CFTR氯离子通道的抑制作用，以及中药槟榔首次被发现具有抗泻的新活性;本研究获得的活性小分子化合物/组分在离体组织和体内的条件下对CFTR介导的氯离子转运均具有明显的抑制作用，说明冬凌草甲素以及公丁香和槟榔的活性组分有希望在分泌性腹泻的新药研发中发挥重要作用。

目录

声明

摘要

引言

第一章 文献研究综述

第一节 囊性纤维化跨膜转运调节因子与腹泻病

1．1．1 囊性纤维化跨膜转运调节因子

1．1．2 囊性纤维化跨膜转运调节因子的相关疾病

第二节 高通量筛选(HTS)

1．2．1 简介

1．2．2 发展及应用

第三节 中国传统药物(TCM)

1．3．1 中药发展现状

1．3．2 中药组分库

第四节 抗癌新星——冬凌草

1．4．1 中医应用

1．4．2 冬凌草甲素药理学研究现状

第五节 传统止泻中药——公丁香

1．5．1 中医应用

1．5．2 公丁香药理学研究现状

第六节 四大南药之首——槟榔

1．6．1 中医应用

1．6．2 槟榔药理学研究现状

第二章 CFTR氯离子通道抑制剂的高通量筛选

第一节 实验材料

2．1．1 细胞

2．1．2 主要试剂和试液配方

2．1．3 主要仪器

第二节 高通量筛选实验方法

2．2．1 前期工作

2．2．2 筛选流程

2．2．3 数据记录与分析

第三节 高通量筛选的结果与分析

2．3．1 初筛

2．3．2 复筛

第四节 结论

第三章 CFTR天然小分子抑制剂和传统中药抗泻机制的药理学研究

第一节 实验材料

3．1．1 细胞

3．1．2 动物

3．1．3 主要试剂和试液配方

3．1．4 主要仪器

第二节 实验方法

3．2．1 传统中药活性组分的分离纯化

3．2．2 细胞荧光检测实验

3．2．3 短路电流测定实验

3．2．4 小鼠肠道液体分泌实验

3．2．5 数据分析

3．2．6 道德声明

第三节 结果与分析

第一部分 中药冬凌草中CFTR天然小分子抑制剂的提取鉴定和药理学的研究

第二部分 传统止泻中药——公丁香的止泻机制探讨

第三部分 传统中药槟榔抗泻活性的发现及药理学研究

总论

主要创新点

参考文献

博士期间所发表的论文

致谢

附录