纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)天然小分子抑制剂的筛选和分子药理活性研究

摘要

纤溶酶原激活物抑制剂1(Plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)是纤溶系统的一个重要的负反馈调节因子。作为机体特异性天然的抑制剂，PAI-1能够快速抑制尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasiminogen activator, uPA)和组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasiminogen activator, tPA)激活调节纤维蛋白溶解过程。PAI-1水平与许多心血管和新陈代谢疾病密切相关，已有的研究表明通过抑制PAI-1活性可能成为血栓栓塞性疾病治疗的新策略。寻找小分子PAI-1抑制剂近年来受到了广泛关注，是目前相关领域研究的热点之一。由于天然化合物在结构多样性、生物相容性等方面具有合成小分子无可比拟的优越性，其在药物发现研究中日益受到重视。本研究利用uPA/PAI-1催化的底物发色法药物筛选模型从300多种天然小分子化合物中筛选到了多种对PAI-1有抑制活性的化合物，包括:丹参酮2A磺酸钠(Sodium tanshinone IIA sulfonate，STS)、隐丹参酮(Cryptotanshinone，CTS)、龙血素B(Loureirin B，LB)、毛两面针素(Toddalolactone，TOD)、左旋紫草素(Shikonin，SHK)和竹节香附素A(Raddeanin A,RA)。在2012年，Xiao[49]等人从天然中药丹参中筛选出丹参酮(STS)和隐丹参酮(CTS)PAI-1天然小分子抑制剂。本实验室闫冬利用活性分离引导的方法从中药血竭和两面针中也发现龙血素B(Loureirin B，LB)和毛两面针素(Toddalolactone，TOD)。本研究对另外的两种化合物左旋紫草素(Shikonin，SHK)和竹节香附素A(RaddeaninA，RA)作用机制及体内预防血栓和抗纤维化作用进行分析。
　　主要结果:(1)利用uPA/PAI-1催化的底物发色反应实验发现SHK和RA能够以剂量依赖的方式解除PAI-1对uPA活性的抑制作用，IC50分别为30.68土2.32μM和27.66±4.52μM。(2) SDS/PAGE实验结果表明SHK和RA能够抑制PAI-1/uPA复合物的形成，但是SHK对弹性蛋白酶介导的PAI-1的断裂没有影响。(3)体外纤维蛋白溶解实验显示SHK和RA能够显著促进纤溶过程。(4)在FeCl3诱导的小鼠腹动脉血栓模型中，SHK和RA(1 mgkg-1)通过腹腔注射给药均能够显著减轻动脉血栓的形成并延长血流时间，说明这两种化合物对血栓形成具有预防作用。(5)在CCl4诱导的肝纤维化模型实验中，SHK和RA(1 mgkg-1)通过腹腔注射持续给药两周后，结果显示与对照组相比给药组小鼠血浆中的羟脯氨酸含量明显降低，肝纤维化程度明显减轻。
　　结论，本研究发现左旋紫草素和竹节香附素A能够显著抑制PAI-1活性从而影响PAI-1/uPA复合物的形成，上述两种化合物在体内条件下能够显著抑制模型小鼠血栓形成并对肝纤维化有较好的治疗作用。该研究发现了左旋紫草素和竹节香附素A抗血栓和抗纤维化的新活性，为以PAI-1为靶点的抗血栓和抗纤维化治疗提供了先导化合物。

目录

声明

摘要

绪论

1 研究背景

1．1 纤维蛋白溶解系统简介

1．2 PAI-1

1．2．1 PAI-1的生理学特性

1．2．2 PAI-1的作用

1．2．3 PAI-1与血栓

1．2．4 PAI-1与肝纤维化

1．2．5 PAI-1与其它相关疾病

1．3 PAI-1抑制剂

1．3．1 PAI-1抑制机理

1．3．2 PAI-1印制剂的研究进展

1．4 萘醌类化合物概述

1．5 皂苷类化合物概述

1．6 本实验研究的目的与意义

2 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要的生化和分子生物学试剂

2．1．2 人血浆样本

2．1．3 实验动物

2．1．4 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 PAI-1抑制剂的筛选原理与方法

2．2．2 利用uPA／PAI-1催化的底物发色法直接检测PAI-1的活性

2．2．3 检测小分子对血浆纤维蛋白溶解的影响

2．2．4 利用SDS电泳法检测小分子对PAI-1／uPA复合物的形成的影响

2．2．5 利用SDS电泳法检测小分子对弹性蛋白酶介导的PAI-1分子的断裂影响

2．2．6 FeCl3诱导的小鼠腹动脉血栓模型的建立及测定方法

2．2．7 CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型的建立及测定方法

2．2．8 数据统计分析

3 结果与分析

3．1 PAI-1天然小分子抑制剂的筛选结果

3．1．1 PAI-1天然小分子抑制剂的结构式

3．1．2 uPA及uPA-PAI-1的活性测定动力学曲线

3．2 左旋紫草素活性测定结果与分析

3．2．1 左旋紫草素对PAI-1的活性具有抑制作用

3．2．2 左旋紫草素对血纤维蛋白溶解的影响

3．2．3 左旋紫草素对uPA-PAI-1复合物的形成的影响

3．2．4 左旋紫草素对弹性蛋白酶介导的PAI-1分子的断裂影响

3．2．5 左旋紫草素对血栓形成的预防作用分析

3．2．6 左旋紫草素对肝纤维化的治疗作用分析

3．3 竹节香附素A(Raddeanin A)活性测定结果与分析

3．3．1 竹节香附素A对PAI-1抑制作用分析

3．3．2 竹节香附素A对血纤维蛋白溶解的影响

3．3．3 竹节香附素A对uPA-PAI-1复合物的形成的影响

3．3．4 竹节香附素A对血栓形成的预防作用分析

3．3．5 竹节香附素A对肝纤维化的治疗作用分析

4 讨论

4．1 发现了SHK和RA对PAI-1具有抑制作用，为SHK和RA增添了新的作用靶点

4．2 SHK和RA对FeCl3诱导的小鼠腹动脉血栓形成具有预防作用

4．3 SHK和RA对CCl4诱导的小鼠肝纤维化具有治疗作用

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢