西青果总酚酸提取工艺及抗创面感染研究

摘要

目的:本文以藏药西青果为主要研究对象，通过响应曲面法对西青果总酚酸的提取工艺进行考察;利用大孔树脂以及硅胶柱层析等方法分离活性化合物;分别以没食子酸和鞣花酸为对照品，运用色谱法对西青果进行质量标准研究;并对西青果总酚酸以及分离得到的化合物进行抗菌活性研究，并初步探讨其作用机制，从而为开发西青果药材奠定理论基础。
　　方法:
　　1.以总酚酸的综合评分为指标，对总酚酸的提取工艺进行考察，并利用响应曲面法(RSM)预测最优提取方法。
　　2.通过大孔树脂以及硅胶柱层析等方法分离活性化合物，并利用理化性质和波谱方法鉴定了3个化合物的化学结构。
　　3.以没食子酸以及鞣花酸分别为对照品，采用高效液相色谱法(HPLC)，测定西青果药材中没食子酸以及鞣花酸的含量，从而对西青果进行质量控制。
　　4.选择临床分离的革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（产气肠杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌）为研究对象，对西青果总酚酸以及分离得到的单体化合物进行体外抗菌实验，并通过电镜和结晶紫染色法初步探讨抗菌机制。
　　结果:
　　1.最优提取工艺为回流提取3.39h，溶剂用量为24.67倍，溶剂浓度为74.66％。结合实际情况将提取条件改为回流提取3h，溶剂用量25倍，溶剂浓度为75％，综合评分为73.71。
　　2.分离得到5个化合物，鉴定了其中的3个，分别为没食子酸、鞣花酸以及阿江榄仁素。
　　3.经HPLC测定，没食子酸的含量为1.74％。鞣花酸含量为0.58％。
　　4.阿江榄仁素比其他两种化合物的抗菌作用显著，其中对金黄色葡萄球菌以及粪肠球菌的抑制作用最为明显。同时随着化合物浓度的增高，生物膜的数量也随之减少;生物膜荧光染色结果表明，阿江榄仁素不仅能够减少生物膜中的活菌数量而且死菌数量也有所减少。
　　结论:
　　1.利用响应曲面法对西青果总酚酸的提取工艺进行考察，与传统工艺相比，结果更精确，准确度更高。
　　2.利用高效液相色谱方法，以没食子酸以及鞣花酸为对照品，测定西青果药材中没食子酸以及鞣花酸的含量，可以更加系统和准确的控制西青果药材质量。
　　3.阿江榄仁素抗菌机制可能与破坏细菌细胞膜有关，并对细菌形成的生物膜也有明显的抑制作用。

目录

声明

摘要

引言

1 文献综述

1．1 创面愈合的影响因素

1．1．1 巨噬细胞促进创面修复

1．1．2 血液中多种因子促进创面愈合

1．1．3 脂肪组织促进创伤修复

1．1．4 雌激素加速创面修复

1．2 中药治疗创面感染的机制研究

1．2．1 抑制细胞壁的合成

1．2．2 抑制细胞膜的合成

1．2．3 抑制或干扰细菌细胞蛋白质合成

1．2．4 抑制核酸合成

2 西青果总酚酸提取工艺研究

2．1 实验材料及仪器

2．1．1 实验材料及试剂

2．1．2 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1．测定方法学研究

2．2．2 西青果总酚酸提取工艺研究

2．3 实验结果

2．3．1 测定方法学研究结果

2．3．2 工艺研究结果

2．4 实验小结

3 西青果活性化合物的提取分离及结构鉴定

3．1 实验材料及仪器

3．1．1 实验材料及试剂

3．1．2 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1．西青果总酚酸的提取

3．2．2．西青果总酚酸的分离

3．2．3．薄层色谱检识

3．2．4．分离流程图

3．3 实验结果

3．3．1 西青果活性化合物的名称和结构

3．3．2 化合物的结构鉴定

3．4 实验小结

4 西青果总酚酸中没食子酸及鞣花酸的含量测定

4．1．实验仪器及材料

4．1．1 试剂与材料

4．1．2 仪器

4．2．实验方法

4．2．1 对照品溶液的制备

4．2．2 供试品溶液的制备

4．2．3．色谱条件

4．2．4 标准曲线的制备

4．2．5 稳定性试验

4．2．6 精密度试验

4．2．7 重复性试验

4．2．8 加样回收试验

4．2．9 样品含量测定

4．3．实验结果

4．3．1．色谱条件

4．3．2．标准曲线的绘制结果

4．3．3 稳定性实验结果

4．3．4 精密度实验结果

4．3．5 重复性实验结果

4．3．6 加样回收实验结果

4．3．7 样品含量测定结果

4．4 实验小结

5 西青果总酚酸及活性化合物抗菌活性研究

5．1 实验材料及仪器

5．1．1 实验材料及试剂

5．1．2．实验仪器

5．1．3．菌株

5．2．实验方法

5．2．1．样品溶液制备

5．2．2．菌液的制备及菌落数的确定

5．2．3．体外抗菌实验

5．3．实验结果

5．3．1．OD值与菌落数的关系

5．3．2．MIC及IC50的测定结果

5．3．3．透射电镜实验结果

5．3．4 生物膜的抑制性实验结果

5．3．5 生物膜荧光染色实验结果

5．3．6．给药后生物膜的荧光染色结果

5．4 实验小结

结论

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢