重组七鳃鳗LIP对肿瘤细胞杀伤机制——基于胞内信号通路研究

摘要

细胞的死亡是一种不可逆的过程，预示着生命的结束。造成细胞死亡的原因有很多，包括一切的损伤因子及恶劣的环境。死亡的细胞与正常细胞相比有明显的变化，例如:胞内ROS大量爆发、细胞器解体等。目前科学领域认知的细胞死亡方式包括三种，分别为细胞凋亡(apoptosis)、细胞坏死(necrosis)及细胞焦亡(pyroptosis)。其中细胞凋亡是由基因所调控的细胞主动死亡方式，其发生依赖于含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族分子（capase家族），最终由caspase3/7执行功能，Z-VAD是其通路上的关键性抑制剂。细胞坏死的发生依赖于RIP3分子且细胞反应剧烈，在坏死过程中伴有炎症反应，Nec-1能有效抑制细胞坏死的发生。细胞焦亡是一种近年才被认可的细胞死亡方式，过程中需要大量的caspasel分子，同时也伴随着炎症分子的释放。研究表明，VX-765可以抑制细胞焦亡上游关键性分子IL-1β，从而有效的抑制细胞焦亡。
　　通过研究发现，rLIP（重组七鳃鳗LIP）在杀伤MCF-7细胞时，会对细胞的线粒体造成明显的破坏。在形态结构上使原本呈现棒状或线状的线粒体断裂，皱缩成球状。破坏线粒体膜，使存在于线粒体内膜上的氧化呼吸链产生大量电子漏，爆发ROS。进而通过半胱天冬酶家族(caspase家族)分子的级联放大反应，最终使caspase3/7大量释放。改变细胞内质网结构，使其肿胀、空泡化。促使内质网中的Ca2+大量释放，对胞内多种蛋白质加工产生障碍，严重破坏细胞内环境的稳定。破坏细胞骨架，使微丝微管解聚，严重影响了细胞分裂、生长、物质运输等重要生命活动。使细胞内TNF-α、IL-8、IL-1β等炎症因子上调。激活多条胞内死亡通路，使掌管细胞焦亡的caspasel、引起细胞坏死的RIPK1/RIP3等重要通路分子上调。
　　进一步探索rLIP在杀死MCF-7细胞时，是否激活三种经典的细胞死亡通路。实验发现单独封闭细胞凋亡(Z-DEVD/Z-VAD)、细胞焦亡(VX-765/Z-YVAD)及细胞坏死(Nec-1)通路都不能抑制LIP造成的细胞死亡。于是尝试将细胞死亡的三条通路全部封闭，结果显示也不能抑制rLIP杀伤细胞，说明其杀伤方式复杂，不是熟知的途径。实验发现，使用PI-PLC将MCF-7细胞表面受体切除后，再加入rLIP，能有效阻断rLIP造成的细胞胞内变化。说明rLIP在杀伤MCF-7细胞时的作用靶点是细胞表面的GPI-APs。
　　该研究发现了rLIP在杀伤MCF-7细胞时，识别的靶点是胞上的GPI-APs，且造成的细胞死亡可能是一种全新的途径。本论文的研究为rLIP对肿瘤细胞杀伤机制奠定基础，也为临床上治疗癌症提供了新的方向。

目录

声明

摘要

引言

1．绪论

1．1 细胞死亡的胞内变化

1．1．1 线粒体在细胞死亡过程中的变化

1．1．2 ROS在细胞死亡过程中的作用

1．1．3 Ca2+在细胞死亡过程中的作用

1．2 细胞死亡的经典途径

1．2．1 细胞凋亡

1．2．2 细胞坏死

1．2．3 细胞焦亡

研究意义

2．重组七鳃鳗LIP引起MCF-7细胞线粒体变化

2．1 实验材料

2．1．1 主要材料

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 rLIP对MCF-7细胞线粒体结构的破坏作用

2．2．2 rLIP引起MCF-7细胞ROS爆发

2．2．3 rLIP刺激MCF-7细胞caspase3／7释放

2．3 实验结果

2．3．1 rLIP对MCF-7细胞线粒体结构的破坏作用

2．3．2 rLIP引起MCF-7细胞ROS爆发

2．3．3 rLIP刺激MCF-7细胞caspase3／7释放

2．4 讨论

3．重组七鳃鳗LIP引起MGF-7细胞内质网变化

3．1 实验材料

3．1．1 主要材料

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 rLIP对MCF-7细胞内质网结构的破坏

3．2．2 rLIP引起MCF-7细胞Ca2+爆发

3．3 实验结果

3．3．1 rLIP对MCF-7细胞内质网结构的破坏

3．3．2 rLIP引起MCF-7细胞Ca2+爆发

3．4 讨论

4．重组七鳃鳗LIP引起细胞骨架破坏及炎症因子上调

4．1 实验材料

4．1．1 主要材料

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 rLIP对MCF-7细胞骨架的破坏

4．2．2 rLIP引起细胞炎症因子上调

2．2．3 rLIP引起细胞死亡重要通路分子变化

4．3 实验结果

4．3．1 rLIP对MCF-7细胞骨架的破坏

4．3．2 rLIP引起细胞炎症因子上调

4．3．3 rLIP引起细胞死亡重要通路分子变化

4．4 讨论

5．重组七鳃鳗LIP杀伤癌细胞激活相关死亡通路探索

5．1 实验材料

5．1．1 主要材料

5．1．2 主要试剂

5．1．3 主要仪器

5．2 实验方法

5．2．1 rLIP杀伤MCF-7细胞是否为凋亡方式的探索

5．2．2 rLIP杀伤细胞是否为焦亡方式的探索

5．2．3 rLIP杀伤MCF-7细胞是否为坏死方式的探索

5．2．4 通路抑制剂对rLIP杀伤细胞影响

5．2．5 rLIP作用靶点的探究

5．3 实验结果

5．3．1 rLIP杀伤MCF-7细胞是否为典型细胞凋亡方式的探索

5．3．2 rLIP杀伤细胞是否为焦亡方式的探索

5．3．3 rLIP杀伤MCF-7细胞是否为细胞坏死方式的探索

5．3．4 通路抑制剂对rLIP杀伤细胞影响

5．3．5 rLIP作用靶点的探究

5．4 讨论

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文情况

致谢