吩噻嗪类药物与蛋白质相互作用及其声动力活性的光谱法研究

摘要

声动力疗法（Sonodyanmic therapy，SDT）是在光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)的基础上建立和发展起来的一种治疗肿瘤的新方法，由日本学者Umemura等于1989年依据超声与血卟啉对肿瘤细胞的协同杀伤效应首次提出。SDT最显著的特点是能够把超声能量聚焦在组织深处的恶性肿瘤部位，局部激活特异性积聚在肿瘤部位的声敏剂产生细胞毒性，从而把对周围健康组织的损伤降低到最小程度。与激光和微波等治疗模式相比，SDT在非浅表肿瘤的非侵入式治疗方面显现出独特的优势，因而被认为是一种极具应用前景的肿瘤靶向治疗手段。
　　近年来，人们采用不同的超声参数和声敏剂对超声与药物在体内与体外的协同抗肿瘤效应及机理进行了大量的研究。但这些工作都是以肿瘤细胞为损伤目标，通过诱导肿瘤细胞凋亡而达到治疗肿瘤的目的，对SDT的细胞内作用靶点的研究却很少。对细胞内物质尤其是细胞内含量非常丰富的蛋白质的损伤，可能是杀伤肿瘤细胞更有效的方法。如果肿瘤细胞内的蛋白质被超声照射的声敏剂损伤，整个细胞将会非正常凋亡。
　　声敏剂是影响SDT疗效的一个重要因素。目前，SDT研究中使用的声敏剂主要来源于光敏剂。在PDT中作为光敏剂用于抗肿瘤的吩噻嗪类衍生物亚甲蓝(Methylene blue，MB)和甲苯胺蓝(Toluidine blue，TB)已被证实具有声动力活性。表明吩噻嗪类衍生物有可能作为声敏剂用于SDT。此外，由于药物与血清白蛋白(Serum albumin，SA)的结合性质会影响到药物的分布、代谢和疗效，因而药物与血清白蛋白的相互作用研究将为药物的药效学和药物代谢动力学提供重要的信息。而且还会提供关于决定药物疗效结构特征的信息，该研究已经成为生命科学、化学和临床医学的重要研究领域。
　　本文采用光谱法研究了三种吩噻嗪类药物盐酸异丙嗪(Promethazine hydrochloride，PMT)、盐酸二氧丙嗪(Dioxopromethazine hydrochloride，DPZ)和MB与血清白蛋白的相互作用及其声动力活性。研究结果如下:
　　1.采用荧光光谱和吸收光谱研究了PMT与牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)的相互作用。PMT对BSA的荧光产生了较强的猝灭作用。荧光猝灭和吸收光谱表明其为形成复合物的静态猝灭过程。计算了不同温度下的结合常数和结合位点数。BSA-PMT的结合距离小于7nm，表明BSA与PMT之间存在非辐射能量转移，但非辐射能量转移引起荧光猝灭的概率比静态猝灭要小。根据van't Hoff方程测定了PMT与BSA相互作用的热力学参数。PMT与BSA相互作用过程的ΔG小于零，表明二者之间的相互作用是自发进行的;PMT与BSA相互作用过程的ΔH和ΔS均小于零，说明二者之间的结合反应是主要由焓驱动的自发过程。二者之间的主要作用力是静电作用力，氢键或van der Waal's力也发挥了一定作用。此外，同步荧光光谱及三维荧光光谱的研究结果表明，PMT与BSA的相互作用使BSA的构象发生了改变。
　　2.采用荧光光谱、吸收光谱和圆二色光谱(Circular dichroism，CD)研究了DPZ与人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)的相互作用。荧光光谱的研究结果表明，DPZ对HSA内源荧光产生了较强的猝灭作用，DPZ对HSA荧光猝灭过程为静态猝灭过程。DPZ与HSA的结合距离小于7nm，说明HSA与DPZ之间存在非辐射能量转移，但非辐射能量转移引起荧光猝灭的概率比静态猝灭要小。测定了DPZ与HSA相互作用过程的热力学参数。ΔG小于零，表明二者之间的相互作用是自发进行的。DPZ与HSA相互作用过程的ΔS＞0且ΔH＜0，表明DPZ与HSA之间主要作用力类型是疏水作用，但是不排除静电作用力的存在。竞争实验结果表明，DPZ在HSA上的结合部位为位于亚结构域IIA的siteⅠ位。此外，吸收光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱及CD光谱的研究结果表明，DPZ与HSA的相互作用使HSA的构象发生了改变。
　　3.采用荧光光谱和吸收光谱研究了MB在HSA上的结合位点，同时研究了Cu2+和Fe3+对MB与HSA结合作用的影响。以酮基布洛芬和布洛芬分别为siteⅠ和siteⅡ位点标记物进行竞争实验，结果表明MB在HSA上的结合部位为位于亚结构域IIA的siteⅠ位。在Cu2+和Fe3+存在下，MB与HSA相互作用的结合常数均有不同程度的提高，表明不同金属离子对MB与HSA的相互作用产生的影响是不同的。Cu2+和Fe3+的存在均可导致MB的最大作用强度降低，但会延长药物的作用时间。Cu2+和Fe3+的存在对MB与HSA相互作用的结合距离几乎没有影响，HSA的构象没有因为与Cu2+或Fe3+的结合而改变，表明MB与HSA结合能力的增加是因为形成的金属离子-HSA-药物三元复合物比HSA-药物二元复合物更为稳定。
　　4.以BSA为蛋白质模型，采用荧光光谱研究了MB、PMT和DPZ存在时对蛋白质的声动力损伤。采用氧化-萃取分光光度法研究了超声与药物协同作用的机理。结果表明，药物可提高超声对蛋白质损伤的程度。同步荧光光谱、三维荧光光谱及CD光谱的研究结果表明超声与药物共同作用比单独超声照射和单独药物作用时导致蛋白质损伤的程度更严重。超声与药物共同作用导致蛋白质的损伤主要是由超声激活药物产生的活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)引起的。由于体系内ROS产生量的增加，蛋白质的损伤程度随着超声时间的延长和药物浓度的增加而增加。采用氧化-萃取-分光光度法和ROS清除剂的研究结果表明超声激活MB、PMT和DPZ产生的导致蛋白质损伤的ROS种类均主要是1O2和·OH;另外，超声激活DPZ产生的ROS中还有其它种类的ROS存在。以上研究结果表明吩噻嗪类化合物MB、PMT和DPZ均具有声动力活性，有可能作为声敏剂应用于SDT。

目录

声明

摘要

缩写表

第1章 绪论

1．1 药物与血清白蛋白相互作用研究现状

1．1．1 血清白蛋白简介

1．1．2 研究药物与血清白蛋白相互作用的意义

1．1．3 药物与血清白蛋白相互作用的研究方法

1．2 声动力疗法研究概况

1．2．1 肿瘤治疗方法

1．2．2 声动力疗法及其研究进展

1．3 本文选题意义和设计思路

第2章 盐酸异丙嗪与牛血清白蛋白相互作用研究

2．1 本章引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验仪器

2．2．2 实验试剂

2．2．3 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 PMT与BSA相互作用的荧光光谱研究

2．3．2 PMT与BSA相互作用的吸收光谱研究

2．3．3 PMT与BSA相互作用的结合常数与结合位点数

2．3．4 PMT与BSA相互作用的热力学参数及作用力类型判断

2．3．5 PMT与BSA间的结合距离

2．3．6 PMT对BSA构象的影响

2．4 本章小结

第3章 盐酸二氧丙嗪与人血清白蛋白相互作用研究

3．1 本章引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验仪器

3．2．2 实验试剂

3．2．3 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 DPZ与HSA相互作用的荧光光谱研究

3．3．2 DPZ与HSA相互作用的热力学参数及作用力类型判断

3．3．3 DPZ与HSA间的结合距离

3．3．4 DPZ与HSA相互作用的结合位点

3．3．5 DPZ对HSA构象的影响

3．4 本章小结

第4章 铜、铁离子对亚甲蓝与人血清白蛋白相互作用的影响

4．1 本章引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验仪器

4．2．2 实验试剂

4．2．3 实验方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 MB与HSA相互作用的荧光光谱与吸收光谱研究

4．3．2 MB与HSA相互作用的结合位点

4．3．3 Cu2+和Fe3+存在条件下MB与HSA相互作用的荧光光谱研究

4．3．4 Cu2+和Fe3+对MB与HSA的结合常数及结合位点数的影响

4．3．5 Cu2+和Fe3+对MB与HSA间结合距离的影响

4．3．6 Cu2+和Fe3+对HSA构象的影响

4．4 本章小结

第5章 超声激活吩噻嗪类药物损伤蛋白质及其机理研究

5．1 本章引言

5．2 实验部分

5．2．1 实验仪器

5．2．2 实验试剂

5．2．3 实验方法

5．3 结果与讨论

5．3．1 超声激活吩噻嗪类药物损伤蛋白质的吸收光谱与荧光光谱

5．3．2 吩噻嗪类药物浓度对蛋白质损伤程度的影响

5．3．3 超声时间对蛋白质损伤程度的影响

5．3．4 超声激活吩噻嗪类药物产生活性氧种类的确定

5．3．5 蛋白质构象的改变

5．4 本章小结

第6章 结论与展望

6．1 结论

6．1．1 药物与血清白蛋白相互作用研究

6．1．2 金属离子对药物与血清白蛋白相互作用的影响

6．1．3 超声激活吩噻嗪类药物损伤蛋白质及机理研究

6．2 展望

6．2．1 药物与血清白蛋白相互作用及影响因素研究

6．2．2 吩噻嗪类药物声动力活性研究

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文与研究成果