SRB方法定量检测体外诱导的HaCaT细胞凋亡及人参皂甙对凋亡的影响

摘要

最近的研究表明角质形成细胞的凋亡在湿疹性皮炎慢性化中起着关键的作用。角质形成细胞的凋亡导致细胞间连接的破坏，真皮内水分渗入表皮内，在表皮内形成海绵样病变，这可以使皮肤的屏障功能受到损害，从而加重湿疹性皮炎。因此，角质形成细胞的凋亡为湿疹性皮炎慢性化的转折点，阻断角质形成细胞的凋亡可以减轻湿疹慢性化进程的发生，从而为湿疹性皮炎的治疗提供了一条新的途径，成为药物筛选的一个新靶点。流式细胞仪可以定量检测细胞的凋亡，此方法虽然敏感准确，但是需要一定量的细胞和大量的试剂，并且操作复杂、耗时，不适合用于高通量的药物筛选。SulphorhodamineB(SRB)和Microtetrazolium(MTT)方法是检测细胞增殖情况的快速、简便的96孔板检测方法，如果能区分出细胞的增殖抑制是由凋亡而不是坏死引起的，就可用此方法初步筛选抑制细胞凋亡的药物。本实验中用干扰素-γ(IFN-γ)和抗Fas单克隆抗体(antiFasAb)共同作用诱导角质形成细胞HaCaT凋亡，部分模拟湿疹性皮炎的发病机制，以用于筛选治疗湿疹性皮炎的药物。通过比较SRB和MTT两种检测方法选用更敏感、准确的SRB方法以及用流式细胞仪同步监测SRB检测结果，建立了用SRB初步筛选抗细胞凋亡药物的方法，从而为筛选湿疹性皮炎的治疗药物奠定了实验基础。 方法：IFN-γ和antiFasAb单独或联合作用于体外培养的角质形成细胞株HaCaT，流式细胞仪检测细胞表面Fas抗原的表达和细胞的凋亡情况并检测caspase抑制剂z-VAD-FMK对HaCaT细胞凋亡的影响。比较SRB和MTT方法在线性、日内变异及日间变异上的差异，选用更精确的方法检测HaCaT细胞的增殖情况。流式细胞仪同步检测SRB方法的检测结果，以确定用SRB方法筛选抑制角质形成细胞HaCaT凋亡的人参皂甙。 结果：(1)流式细胞仪检测结果显示IFN-γ浓度分别为0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml时，HaCaT细胞表面的Fas抗原表达分别49.66﹪±6.90、63.54﹪±6.38、71.41﹪±6.03、77.58﹪±5.92、79.31﹪±4.80。1ng/ml的IFN-γ上调Fas表达不明显(P＞0.05)，但是10ng/ml以上浓度的IFN-γ可显著增加Fas表达(P＜0.05)。(2)流式细胞仪检测结果显示50ng/ml的IFN-γ和25ng/ml的antiFasAb共同作用可以诱导角质形成细胞HaCaT凋亡，凋亡率可达到21.5﹪。Caspase抑制剂z-VAD-FMK可有效抑制IFN-γ和antiFasAb共同作用引起的HaCaT细胞凋亡。(3)SRB方法和MTT方法都有非常好的线性，相关系数分别为0.99896和0.99724，两种方法间无显著性差异。SRB和MTT方法在日内变异上无显著性差异，而在日间变异上SRB方法小于MTT方法，两种方法间有显著性差异。(4)流式细胞仪与SRB方法同步检测结果表明，固定IFN-γ浓度为50ng/ml，添加antiFasAb25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、0.5μg/ml、1μg/ml时，流式细胞仪检测的细胞凋亡率分别为25.39﹪、24.39﹪、28.4﹪、31.58﹪、40.52﹪、46.67﹪，而SRB方法检测的细胞增殖抑制率分别为29.8﹪、30.69﹪、32.79﹪、36.83、43.69、47.19﹪，两种方法检测结果的相关系数为0.9934，应用两组间t检验，P＞0.05,在统计学上无显著性差异。(5)人参皂甙Mx、CK和Re对HaCaT细胞凋亡有一定的抑制作用，抑制率分别为18.4﹪、14.5﹪、9.6﹪。 结论：(1)IFN-γ和antiFasAb共同作用可诱导角质形成细胞HaCaT凋亡。(2)SRB方法比MTT方法更灵敏、更稳定，更适合药物的高通量筛选。(3)流式细胞仪与SRB方法同步检测结果显示，在明确细胞的增殖抑制是由凋亡而非坏死引起时，SRB方法可以用于凋亡的定量检测，即SRB方法可用于初步筛选抑制细胞凋亡的药物。(4)人参皂甙Mx，CK，和Re对IFN-γ和antiFasAb诱导的HaCaT细胞凋亡有一定的抑制作用。

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摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 湿疹性皮炎的发病机理研究

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