传代对红色毛癣菌表型和核糖体基因序列的影响

摘要

本文将6株不同表型的红色毛癣菌传至20代，比较传代前后表型的变化；并且用PCR法对6株红色毛癣菌原代及第20代的核糖体保守区(5.8S和ITS2)和非转录间隔区(NTS)内的两个重复亚单位(TRS1，TRS2)扩增，序列测定，比较原代与第20代基因型及序列有无变化，从而探讨传代对红色毛癣菌表型和基因型稳定性的影响。 材料和方法：标准株为美国标准培养标本ATCC294(Americantypecult-urecollection)保存菌株，红色毛癣菌临床分离株5株。根据菌株的形态，生理生化学鉴定为红色毛癣菌。所有菌株采用沙氏琼脂试管培养基培养，间隔14天传代1次，均传至20代。表型的变异依据菌落的形态及色素。分别对6株原代及第20代的菌株，以真菌保守区核糖体基因和ITS2基因区内引物(引物1序列为5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’，引物2序列为5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，用PCR法扩增，基因序列测定，核苷酸同源性检索用BLAST软件进行分析。再以TrNTSF-2(5’-ACCGTATTAAGCTAGCGCTGC-3’)，TrNTSR-4(5’-TGCCACTTCGATTAGGAGGC-3’)和TrNTSR-1(5’-CTCAGTCGAACCGTGAGGC-3’)，TrNTSC-1(5’-CGAGACCACGTGATACATGCG-3’)两对引物分别扩增6株原代及相应的第20代红色毛癣菌的TRS1区和TRS2区，基因序列测定，结果用clustalx软件进行比较分析。 结果：(1)6株红色毛癣菌经传至20代，菌落形态、质地及色素随之变异，第一次传代至第20代变异率由33.3﹪增至100.0﹪。形态逆转率100.0﹪，色素逆转率50.0﹪。(2)核糖体保守区(部分5.8s和ITS-2)基因序列测定，片段大小均约为320bp，与基因库红色毛癣菌标准株ATCC28188基因序列比，其同源性均达99﹪，再次证明，经传代后的菌仍为红色毛癣菌。(3)在部分5.8S和ITS-2区、TRS-1区、TRS-2区进行PCR扩增，原代及第20代的PCR指纹图无差异。(4)对原代及相应第20代的NTS区中TRS-1区、TRS-2区测序，重复单位数目和长度一致，表明红色毛癣菌的基因型相对稳定。但重复单位中个别碱基发生改变，标准株的第20代与原代比，第一个重复序列中第39，40位碱基CC→TT。 结论：(1)红色毛癣菌表型不稳定，极易受到外界因素的影响，在传代和保藏的过程中其菌落形态、产色极易发生变异，表明传代是使其表型发生变化的一个不容忽视的因素。(2)本研究在国内外首次应用基因序列测定对传代前后的红色毛癣菌的核糖体基因进行分析。(3)对6株红色毛癣菌传代前后的核糖体部分5.8S和ITS-2区、TRS-1区、TRS-2区的PCR指纹图及测序结果，表明红色毛癣菌的核糖体基因稳定。

目录

独创性声明及学位论文版权使用授权书

摘要

引言

第一部分:传代对红色毛癣菌表型的影响

第二部分 传代对红毛癣菌核糖体基因序列的影响

结论

参考文献

综述 核糖体基因间隔区在医用真菌中的应用价值

致谢