雪旺细胞体外分离培养及甲基强地松龙对雪旺细胞分泌功能影响的研究

摘要

神经再生室技术的出现，解决了短距离神经再生的问题。但是除自体神经移植外，其他人工修复技术尚无法解决长距离神经缺损的问题。尽管组织工程技术在不断发展，但体外构建的“人工神经”还没有从本质上超越再生室技术。其原因是组织工程中作为种子细胞的细胞老化、分泌能力下降等诸多问题。雪旺细胞是周围神经最主要的胶质细胞，也是最重要的种子细胞。雪旺细胞分泌多种神经营养因子在神经再生中发挥关键作用，但其分泌能力受诸多因素影响，甲基强地松龙(MP)被认为是一种通过抑制脂质过氧化而对神经细胞及其突起发挥保护作用的药物。 目的： 1．采用新生SD大鼠的雪旺细胞作为周围神经组织工程的种子细胞，在体外分离培养，探索体外培养及增殖雪旺细胞的方法。 2．选取生长状况和纯度较好的第二代细胞，将经胰酶消化下来的细胞接种到六孔板中，以不同浓度的MP作用于雪旺细胞，以研究MP对雪旺细胞分泌功能影响。 方法： 1．取SD大鼠的新生鼠双侧的坐骨、臂丛神经，剪碎至1mm3大小的组织块，双酶消化法进行分离培养，阿糖胞苷抑制成纤维细胞生长，低浓度胰酶快速消化传代进一步纯化雪旺细胞，用光镜进行形态学观察、S-100蛋白进行鉴定。 2．取生长状况较好的第二代细胞，将经胰酶消化下来的细胞接种到六孔板中，以不同浓度的MP(10-3、10-4、10-6、10-8mol/L)作用于雪旺细胞，作用24、48和72h，设立不加药物的空白对照组，并通过RT-PCR的方法半定量检测其分泌的NGF，以研究MP对雪旺细胞分泌功能的影响。 结果： 1．通过上述方法分离培养获得了经S-100蛋白鉴定纯度为88％的第二代雪旺细胞，细胞数量为3.128×107/ml，细胞形态多数为梭形，细胞排列成典型的漩涡状或栅栏状。 2. RT-PCR方法检测后，经Lab works 4.60软件进行分析处理，以内参基因B-actin为基准分析各条带的相对密度值，应用Spass 10.0软件进行统计分析得出结论：10-8mol/L的MP作用72h分泌的NGF与空白对照组比较及与其它浓度、时间组比较表达增加(p<0.05)；10-3 mol/L的MP在各时间段分泌的NGF与空白对照组及其它浓度、时间组比较表达减少(P<0.05)。 结论： 1．新生SD大鼠坐骨、臂丛神经中分离培养雪旺细胞来源确实，取材方便，可以作为周围神经组织工程试验研究的种子细胞来源，采用双酶消化法、阿糖胞苷抑制成纤维细胞生长，可以获得较高纯度的雪旺细胞。 2．不同浓度的MP对雪旺细胞的分泌能力有不同的影响：高浓度(10-3 mol/L)的MP抑制雪旺细胞分泌NGF；长时间、低浓度(72 h，10-8 mol/L)的MP则促进雪旺细胞分泌NGF，故低浓度的MP可以提高雪旺细胞分泌NGF的能力，更好发挥雪旺细胞作为种子细胞的能力。

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结果

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结论

参考文献

综述 人工神经中种子细胞的研究进展

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