鼠尾草酸通过诱导二相酶降低HepG2细胞氧化损伤的作用与PI3K/Akt-Nrf2转录途径之间的关系

摘要

目的:研究鼠尾草酸通过二相酶的诱导对HepG2细胞H2O2损伤的保护作用与PI3K/Akt-Nrf2转录途径之间的关系。
　　 方法:
　　 1.鼠尾草酸对HepG2细胞二相酶的诱导作用
　　 HepG2细胞随机分为四组:对照组;低、中、高浓度鼠尾草酸组(5μM、10μM、20μM)。药物与细胞共同孵育不同时间后分别测定以下指标:采用化学分光光度法测定醌氧化还原酶(NQO1)的活性和还原型谷胱甘肽(GSH)的活性;用免疫印迹法(Western blotting)测定转录因子Nrf2、NQO1和血红素氧合酶-1(HO-1)的蛋白表达。
　　 2.鼠尾草酸对HepG2细胞二相酶诱导的信号转导通路研究
　　 (1)HepG2细胞随机分为:对照组;20μM鼠尾草酸组;20μM鼠尾草酸+阻断剂组(PI3K通路阻断剂LY294002组、NQO1抑制剂Dicoumarol组、HO-1抑制剂ZNPPIX组)。Western blotting法测定转录因子Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表达。
　　 (2)HepG2细胞随机分为:对照组;PI3K阻断剂组;20μM鼠尾草酸组:20μM鼠尾草酸+PI3K阻断剂组。Western blotting法测定Akt和P-Akt的蛋白表达。
　　 3.鼠尾草酸对H2O2损伤的HepG2细胞保护作用研究
　　 (1)HepG2细胞随机分为:对照组;H2O2损伤组(终浓度为2.4mM);低、中、高浓度鼠尾草酸治疗组(5μM、10μM、20μM)。采用MTT法测定细胞存活率;采用化学分光光度法测定细胞上清液中LDH活性。
　　 (2)HepG2细胞随机分为:对照组;H2O2损伤组;20μM鼠尾草酸治疗组;20μM鼠尾草酸+阻断剂组。采用MTT法测定细胞存活率;采用化学分光光度法测定细胞中LDH活性。
　　 结果:
　　 1.鼠尾草酸与HepG2细胞共同孵育8h后,与对照组相比,药物组的细胞内二相酶GSH和NQO1活性均明显提高(P＜0.01,P＜0.01),在5～20μM呈浓度依赖性。16h时,上述两种酶的活性均有不同程度的降低,呈一定的时间相关性。
　　 2.鼠尾草酸与HepG2细胞共同孵育8h后,与对照组相比,中、高浓度药物组细胞内Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表达显著提高(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01),并呈一定的浓度依赖性。
　　 3.PI3K通路的特异性阻断剂LY294002可以明显抑制鼠尾草酸诱导的HepG2细胞Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表达(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01)。鼠尾草酸诱导的NQO1和HO-1的蛋白表达还可分别被特异的NQO1抑制剂Dicoumarol、HO-1抑制剂ZNPPIX所抑制(P＜0.01,P＜0.01)。
　　 4.与对照组相比,鼠尾草酸不影响Akt的水平,但可明显增加P-Akt的蛋白表达水平。在鼠尾草酸同时存在或不存在时,PI3K通路的特异性阻断剂LY294002可明显减少P-Akt的蛋白表达。
　　 5.H2O2刺激HepG2细胞后,与对照组相比,损伤组细胞生存率明显下降,LDH活性明显增高(P＜0.01,P＜0.01),而中、高浓度鼠尾草酸处理组细胞生存率显著提高,LDH活性显著下降(P＜0.01,P＜0.01),呈浓度依赖性。而且,特异性P13K通路阻断剂LY294002、NQO1抑制剂Dieoumarol以及HO-1抑制剂ZNPPIX可以部分取消鼠尾草酸的细胞保护作用。
　　 结论:
　　 1.鼠尾草酸通过激活HepG2细胞的转录途径PI3K/Akt-Nrf2上调二相代谢酶HO-1、NQO1、GSH的活性和蛋白表达,并且呈浓度依赖性和时间相关性。
　　 2.鼠尾草酸对H2O2损伤的HepG2细胞具有保护作用,其机制主要与鼠尾草酸激活PI3K/Akt-Nrf2通路,显著提高HepG2细胞二相代谢酶NQO1、HO-1等的表达有关。