新疆鼠尾草抗血栓作用活性部位筛选及其对凝血酶诱导的细胞损伤的保护作用的研究

摘要

目的：1.筛选新疆鼠尾草抗血栓作用的活性部位。2.研究新疆鼠尾草的抗血栓活性部位对凝血酶诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用。
　　方法：1.新疆鼠尾草地上部分分别依次用甲醇、水、氯仿水浴回流提取各3次（3h、3h、1h），真空干燥分别得到新疆鼠尾草的水提物（SDS-W）、新疆鼠尾草甲醇提取物（SDS-M）、新疆鼠尾草氯仿提取物（SDS-T）。再分别取适量水提物和甲醇提取物用水溶解，分别依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，真空干燥得到水提物乙酸乙酯部位（SDS-WE）、水提物正丁醇部位（SDS-WN）、水提物正丁醇萃取后水溶部位（SDS-WH）、甲醇提取物乙酸乙酯部位（SDS-ME）、甲醇提取物正丁醇部位（SDS-MN）、甲醇提取物正丁醇萃取后水溶部位（SDS-MH）。雄性SD大鼠120只，适应性喂养1w后，随机分为：假手术组、模型组、阳性对照组、SDS-W组、SDS-WE组、SDS-WN组、SDS-WH组、SDS-M组、SDS-ME组、SDS-MN组、SDS-MH组、SDS-T组。分别用新疆鼠尾草的各提取物及萃取物连续灌胃20d，给药期间自由饮食，于末次给药1h后麻醉，用FeCl3诱导大鼠左侧颈总动脉形成血栓模型，造模完毕后剪取血管称重、HE染色制石蜡切片光镜观察各组血栓形成变化；从大鼠腹主动脉采血，采用放射免疫法（RIA）检测血浆中血栓素B2（TXB2）、6-酮前列腺素1α（6-Keto-PGF1α）、内皮素-1（ET-1）的含量，采用酶联免疫双抗体夹心ABC-ELISA法检测vWF的含量，并观察其对于血栓形成的影响。2.人脐静脉内皮细胞（HUVECs）培养至第3～5代，用MTT法筛选合适的细胞饥饿时间、药物作用时间、药物浓度、凝血酶作用时间及浓度；细胞分为8组：正常细胞组、模型组、SDS-W+凝血酶组（低、中、高剂量组）、SDS-MH+凝血酶组（低、中、高剂量组）。按选取的细胞培养条件培养细胞并收集各实验组细胞，运用 QRT-PCR技术和 WB检测细胞的血小板内皮细胞粘附分子-1（PECAM-1）、Toll样受体4（TLR4）、组织因子（TF）、血小板糖Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb/Ⅲa）、P-选择素（Ps）的表达水平，以此观察活性部位对细胞影响。
　　结果：1.与模型组相对比，SDS-W组、SDS-MH组、SDS-WE组、SDS-MN组降低大鼠血栓质量，差异有统计学意义（P<0.05）；SDS-W组、SDS-MH组、SDS-WE组、SDS-WN组、SDS-WH组、SDS-M组、SDS-ME组、SDS-MN组、SDS-T组降低血浆中TXB2水平同时也升高6-keto-PGF1α水平，降低TXB2/6-keto-PGF1α比值，差异有统计学意义（P<0.05）；SDS-W组、SDS-MH组、SDS-WE组、SDS-WN组、SDS-WH组、SDS-M组、SDS-ME组、SDS-MN组、SDS-T组降低血浆中ET-1水平，差异有统计学意义（P<0.05）；SDS-W组、SDS-MH组降低血浆 vWF的浓度，差异有统计学意义（P<0.01）。2.通过MTT实验筛选得到：细胞饥饿时间是12h，SDS-W（浓度分别为0.7μg/mL、7μg/mL、70μg/mL）和 SDS-MH（浓度分别为：1.2μg/mL、12μg/mL、120μg/mL），药物作用时间为24h；凝血酶的最佳作用时间为24h，浓度为60U/ml；1）QRT-PCR的结果为：与模型组相对比，SDS-W给药组（浓度为：7μg/mL、70μg/mL）、SDS-MH给药组（浓度为：12μg/mL、120μg/mL）明显降低 GPⅡb/Ⅲa水平，差异有统计学意义（P?0.05）；与模型组相对比，SDS-W给药组（浓度为：0.7μg/mL、7μg/mL、70μg/mL）、SDS-MH给药组（浓度为：1.2μg/mL、120μg/mL）明显降低 TF水平，差异有统计学意义（P?0.05）；与模型组对比，SDS-W给药组（浓度为：0.7μg/mL、7μg/mL、70μg/mL）、SDS-MH给药组（浓度为：1.2μg/mL、12μg/mL、120μg/mL）明显下调HUVECs的P-选择素水平，差异有统计学意义（P?0.05）；与模型组对比， SDS-W给药组（浓度为：0.7μg/mL、7μg/mL、70μg/mL）、SDS-MH给药组（浓度分别为：1.2μg/mL、12μg/mL、120μg/mL）明显下调PECAM-1水平，差异有统计学意义（P?0.05）；与模型组相对比，SDS-W给药组（药物浓度为0.7μg/mL、7μg/mL、70μg/mL）、SDS-MH给药组（药物浓度为1.2μg/mL、12μg/mL、120μg/mL），明显下调HUVECs的TLR4水平，差异有统计学意义（P?0.05）。2）Western Bloting结果为：与模型组相对比，SDS-W给药组（药物浓度为0.7μg/mL、7μg/mL）、SDS-MH给药组（药物浓度为12μg/mL、120μg/mL）明显下调HUVECs的P-选择素蛋白表达水平，差异有统计学意义（P?0.05）；与模型组相对比，SDS-W给药组（药物浓度为0.7μg/mL、7μg/mL、70μg/mL）、SDS-MH给药组（药物浓度为1.2μg/mL、12μg/mL、120μg/mL）明显下调 HUVECs的 PECAM-1蛋白表达水平，差异有统计学意义（P?0.05）；与模型组相对比，SDS-W给药组（药物浓度为0.7μg/mL、7μg/mL、70μg/mL）、SDS-MH给药组（药物浓度为1.2μg/mL、12μg/mL、120μg/mL），明显下调HUVECs的TLR4蛋白表达水平，差异有统计学意义（P?0.05）；与模型组相对比， SDS-W给药组（药物浓度为0.7μg/mL、7μg/mL、70μg/mL）、SDS-MH给药组（药物浓度为12μg/mL、120μg/mL），明显下调HUVECs的GPⅡb/Ⅲa蛋白表达水平，差异有统计学意义（P?0.05）；与模型组相对比，SDS-W给药组（药物浓度为0.7μg/mL、7μg/mL、70μg/mL）、SDS-MH给药组（药物浓度为12μg/mL、120μg/mL），明显下调HUVECs的TF蛋白表达水平，差异有统计学意义（P?0.05）。
　　结论：1.新疆鼠尾草提取物 SDS-W部位和 SDS-MH部位具有抗血栓作用。2. SDS-MH给药组及SDS-MH给药组对凝血酶诱导的人脐静脉内皮细胞具有保护作用，这可能与抗血小板聚集相关。

目录

声明

中英文缩略词对照表

前言

1 新疆鼠尾草抗血栓作用活性部位的筛选研究

1.1 仪器与材料

1.2 实验方法

1.3 结果

1.4 讨论

2新疆鼠尾草对凝血酶诱导的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用

2.1仪器与试药

2.2实验内容

2.3 统计学处理

2.4 结果

2.5 讨论

小结

致谢

参考文献

综述:鼠尾草属植物化学成分及抗血小板活性研究进展

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