荧光定量PCR检测慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者痰中肺炎链球菌的研究

摘要

目的:1、细菌感染在慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)中占有相当大的比例。应用常规的培养方法检测,其阳性率仅为10％-30%,甚至更低;国外多篇文献报道,肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae,SP)为AECOPD的常见致病菌之一;而我国各地区对该项报道的研究结果却差异较大。本实验旨在建立荧光定量PCR技术对AECOPD患者痰中SP快速检测的方法,与近年来国内外的相关研究进行比较分析,明确该方法相对于传统培养方法的优越性;2、痰培养方法受多种因素制约,目前临床研究多专注于对标本的收集过程、培养操作过程中可能出现的相关问题进行分析,但就痰液本身对细菌生长的影响并无相关报道。本实验通过SP纯菌液自身培养与痰液中混合SP菌液培养相比较,观察痰液本身对SP生长有无影响。
　　 方法:1、收集2010年1月-2011年3月入住我院呼吸科的AECOPD患者59例,其中男性45例,女性14例,年龄51-89岁,有吸烟史者44人,近期应用全身性激素6人;诊断标准参照2007年中华医学会呼吸病学会慢性阻塞性肺疾病诊治指南;留取患者入院前三天的痰标本,无痰者雾化辅助排痰,排痰困难者,可辅助吸痰。对59例患者的痰标本进行培养,观察培养结果;选择自溶素lytA作为SP特异性基因设计标准品、引物及探针,应用RT-PCR技术检测标本中的SP,并根据标本中SP的含量估算SP感染率;2、同等条件下,将SP纯菌液倍比稀释成10-1-10-77个梯度,并选择10-1,10-2,10-3,10-44个稀释度各10μl分别进行培养,同时将痰液混合SP纯菌液培养,其痰中SP的浓度与纯SP菌液相同,对比观察痰液对SP生长的影响。
　　 结果:59例AECOPD患者第一天的合格痰标本培养结果阳性率为22%,其中白色念珠菌7例,阳性率为11.8%,疑为污染所致;其余为:铜绿假单胞菌2例(3.3%),肺炎克雷伯杆菌1例(1.7%),类白喉棒状杆菌1例(1.7%),奇异变形菌1例(1.7%)荧光假单胞菌1例(1.7%),但是标本中无肺炎链球菌的生长;留取三天的合格标本总数为104份,其中PCR.阳性为70份,阳性率为67.3%,明显高于培养的结果(22%)。根据检测结果,我们又可以粗略估计AECOPD中SP的感染情况,从而推断感染SP的患者为18例;对AECOPD入院前用药情况及其他临床相关因素与SP感染情况进行Fisher's检验及x2检验,结果均无显著性差异(P＞0.05)。
　　 一定浓度的SP纯菌液与同样浓度但混有合格痰标本的菌液进行对比培养,菌落的生长相差悬殊,在1.15×105 cfu/ml的纯菌液中,菌落数量＞1000个,而混有痰液后,该浓度的菌落平均数只有个位;1.15×103cfu/ml的纯菌液中,仍有SP生长,而混痰组在此浓度已无SP生长。
　　 结论:
　　 1、荧光定量PCR作为一种快速的检测技术,其对肺炎链球菌检测的阳性率明显高于传统的培养方法；
　　 2、痰液在培养的检测方式中,对于肺炎链球菌的生长有影响。