评价乳腺癌患者外周血单个核细胞诱导培养的CIK细胞中Cbl-b基因表达水平及意义

摘要

目的:
　　 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，虽然经过以手术、化疗、放疗和内分泌治疗为主的综合治疗显著提高了患者生存率、局部控制率，但是总的生存仍不满意。首要原因就是复发与转移。文献报道，自体细胞免疫治疗技术能够显著增强机体免疫功能、预防复发与转移并延长生存期。目前在我国临床开展并运用最成熟、疗效最好的是自体免疫细胞治疗技术。其中，细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK，cytokineinducedkillers)治疗的良好临床疗效已经被普遍认可，CIK细胞是将人体外周血单个核细胞经多种细胞因子刺激后获得的一群异质细胞群;因兼具T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤活性等优点，是新一代抗肿瘤细胞生物治疗的首选方案。
　　 Cbl-b(casitasBcelllymphoma-b)是cbl家族中的成员，是T淋巴细胞的一个负性调控信号分子，对外周T细胞的调控起关键作用。而且Cbl-b也是调节T细胞激活和耐受的关键分子，增强Cbl-b的表达能诱导免疫耐受，防止自身免疫性疾病如糖尿病、多发性硬化的发生;抑制Cbl-b的表达或者功能能改变肿瘤患者T细胞无能状态，打破自身免疫耐受。临床观察发现，CIK细胞治疗过程中，即使培养方法相同、回输方式相同、回输的细胞数也达到标准（1×1010个）、疗程相同，但是疗效却不尽相同。因此我们推测是否由于患者自身T细胞的功能或某些因子表达的差异导致培养的CIK细胞功能出现差异，从而疗效千差万别。本实验中通过检测乳腺癌患者外周血PBMC诱导出的CIK细胞中Cbl-b的表达水平，来探讨不同患者进行CIK细胞治疗时，细胞中Cbl-b基因表达是否有变化，并进一步分析该基因在CIK细胞治疗中所起的重要作用。
　　 方法:
　　 1、选择患者入组，填写知情同意书，记录详尽的疾病病名分期，客观检查指标，现时病期，曾用治疗方法及经过，现时治疗方案，患者一般状况，CIK细胞治疗次数等资料。
　　 2、提取乳腺癌等患者外周血单个核细胞总RNA，提取培养14天的CIK细胞的总RNA。
　　 3、进行Real-timePCR方法检测Cbl-b的mRNA水平表达。
　　 4、SPSS13.0统计分析。
　　 结果:
　　 1、在镜下观察，PBMC细胞经过体外诱导细胞出现母细胞化，分裂相多见，随着时间延长细胞集落逐渐变大数量增多，提示细胞活化增殖能力旺盛。
　　 2、台盼蓝拒染法计数细胞，显示凋亡细胞极少见，活细胞第3天细胞增殖约10倍，至14天，细胞扩增达100倍。
　　 3、流式细胞分析仪分析细胞表型，显示CD3+CD56+、CD3+CD8+细胞比例显著增加(p＜0.05);CD3+CD4+细胞明显降低(p＜0.05)。
　　 4、患者CIK细胞表达Cbl-bmRNA，连续CIK细胞治疗后，第二次治疗的CIK细胞比首次治疗的CIK细胞中表达Cbl-bmRNA水平增加(p＜0.001)，第三次治疗的CIK细胞比首次治疗的CIK细胞中表达Cbl-bmRNA水平增加(p＜0.001)，第三次治疗的CIK细胞与第二次治疗的CIK细胞中表达Cbl-bmRNA水平无显著差异(p＞0.05)。
　　 结论:
　　 1、乳腺癌患者外周血PBMC诱导培养CIK细胞，CIK细胞具有很强的体外增殖能力表达。
　　 2、乳腺癌患者的CIK细胞培养后CD3+CD4+双阳性细胞百分比下调，CD3+CD8+双阳性细胞百分比上调，CD3+CD56+双阳性细胞百分比上调。
　　 3、所有乳腺癌患者各次治疗的CIK细胞均表达Cbl-b基因。
　　 4、乳腺癌患者随着CIK细胞治疗次数的增加，其CIK细胞中Cbl-b基因表达水平也随之增加。

目录

声明

摘要

前言

材料和方法

一、主要仪器设备

二、主要试剂及材料

三、主要试剂的配置

四、病例来源与入选标准

五、治疗情况和标本收集情况

六、PBMC和CIK细胞

七、实验方法

结果

1．患者CIK细胞形态学观察

2．患者CIK细胞的增殖能力

3．患者CIK细胞表型

4．患者CIK细胞表达Cbl-b mRNA，连续CIK细胞治疗后，CIK细胞表达Cbl-bmRNA增加

讨论

结论

参考文献

综述

附录

致谢