人参皂苷Rg3抑制人小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖及下调caveolin-1表达作用的研究

摘要

目的:
　　 人参皂苷Rg3是从五加科植物人参(PanaxginsengC.A.Meyer)中提取出的一种活性物质，属于四环三萜类皂苷。研究表明，人参皂苷Rg3在抑制肿瘤细胞增殖和浸润、诱导细胞凋亡、抗血管生成、抗肿瘤转移、逆转耐药等方面发挥重要作用。
　　 小窝(caveolae)是存在于细胞膜的窝陷型结构，属于脂筏的一种。小窝蛋白(caveolin)是小窝中的标志蛋白，细胞膜胆固醇的含量影响二者的结构和功能的稳定性。小窝蛋白-1(caveolin-1，Cav-1)是三个家族成员中最重要的一员，主要参与各种信号分子在小窝中的聚集，并且在胃癌、前列腺癌、肺癌等多种肿瘤中表达异常。已有研究证实小窝和Cav-1参与细胞增殖、信号传导、物质交换等重要功能。
　　 小细胞肺癌(Smallcelllungcancer，SCLC)是一种恶性程度较高的病理类型，具有倍增时间短、进展迅速等特点，并且常常并发内分泌异常和类癌综合症。人小细胞肺癌胸水转移细胞系(NCI-H446)是1982年由D.Carney，A.F.Gazdar等人从一名小细胞肺癌患者的胸腔积液中分离得到，为小细胞肺癌的变异型。研究表明Cav-1高表达影响了NCI-H446细胞的增殖，并且能够抑制NCI-H446细胞的凋亡。目前人参皂苷Rg3对肿瘤作用机制的研究很广泛，而Rg3对小细胞肺癌及Cav-1是否有抑制作用未见报道。
　　 本实验通过Rg3作用于体外生长的NCI-H446细胞系，观察药物对细胞增殖的影响;通过对比检测用药前后细胞膜小窝数量、Cav-1的分布和表达水平的变化及胆固醇对Rg3的作用影响，初步探讨人参皂苷Rg3抑制NCI-H446细胞增殖的分子机制。
　　 方法:
　　 体外培养NCI-H446细胞系，进行如下实验:
　　 (1)Rg3对NCI-H446形态与细胞增殖的影响:加药组采用Rg3(50μmol/l)培养NCI-H446细胞，连续培养7天，倒置显微镜下观察细胞生长形态，每天细胞计数并绘制生长曲线;用RT-PCR、WesternBlot检测处理第5天、第7天时，细胞核增殖抗原(ProliferatingCellNuclearAntigen，PCNA)表达水平的变化;
　　 (2)Rg3对小窝和Cav-1的影响:加药组采用不同浓度Rg3(0.4μmol/l、2μmol/l、10μmol/l、50μmol/l)，培养24h，用WesternBlot检测Cav-1的表达变化;加药组采用Rg3(50μmol/l)培养NCI-H446细胞24h，透射电镜观察细胞膜小窝数量的变化;蔗糖密度梯度离心法检测Cav-1分布的变化;
　　 (3)胆固醇对人参皂苷Rg3的作用影响:加药组采用人参皂苷Rg3(50μmol/l)、胆固醇(25mmol/l)、Rg3(50μmol/l)联合胆固醇(25mmol/l)共培养24h，用WesternBlot检测Cav-1的表达变化;间接免疫荧光法检测Cav-1分布的变化。
　　 结果:
　　 (1)Rg3对NCI-H446形态与细胞增殖的影响:加药组与对照组相比，出现形态改变且细胞数量明显减少;加药组中PCNA合成减少;
　　 (2)Rg3对小窝和Cav-1的影响:随着Rg3浓度的增加，Cav-1的表达逐渐减少，呈剂量依赖性;透射电镜下可观察到:与对照组（等量无血清培养基）相比，加药组(Rg350μmol/l)的小窝数量明显减少，极少有典型烧瓶样结构;Rg3使Cav-1在非脂筏区表达增加;
　　 (3)胆固醇对人参皂苷Rg3的作用影响:Rg3(50μmol/l)组Cav-1表达减少;Rg3(50μmol/l)组细胞膜Cav-1分布减少，胞质分布增多;在加入胆固醇(25mmol/l)后以上作用减弱。
　　 结论:
　　 (1)人参皂苷Rg3能抑制NCI-H446细胞增殖;
　　 (2)人参皂苷Rg3能减少NCI-H446细胞膜小窝的数量，并能改变Cav-1的分布，明显减少Cav-1的表达;
　　 (3)胆固醇能抑制和减弱人参皂苷Rg3对Cav-1的作用。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

一、材料

二、实验方法

结果

1、人参皂苷Rg3对NCI-H446形态与细胞增殖的影响

2．人参皂苷Rg3对NCI-H446细胞小窝、Cav-1的影响

3．人参皂苷Rg3与胆固醇相互作用对Cav-1的影响

讨论

结论

参考文献

综述

附录

致谢