Oat1,Oat3和Mrp2介导JBP485对大鼠急性肝肾损伤产生的保护作用及其分子药代动力学机制

摘要

目的:急性肝肾损伤是临床常见疾病，前期研究表明，急性肝肾损伤状态下肾脏上有机阴离子转运蛋白1和3(Oat1，Oat3)及多药耐药相关蛋白2（Mrp2）的表达和功能会发生改变。Oat1和Oat3分布在肾小管的上皮细胞基底膜侧，主要转运有机阴离子，Mrp2分布在肝细胞胆管侧膜和肾小管上皮细胞顶侧膜，可转运内源性和外源性物质。ANIT(alpha-naphthylisothiocyanate)可引起胆管细胞坏死，造成胆道梗阻。大剂量顺铂(cisplatin)可引起急性肾损伤。JBP485(cyclo-trans-4-L-Hydroxyprolyl-L-serine，环状-反式-4-左旋-羟脯氨酰-左旋-丝氨酸)是一种二肽（dipeptide），从日本抗肝炎药物Laennec（人胎盘水解物）中分离得到，具有一定的抗炎活性。本课题旨在研究JBP485对ANIT诱导的急性梗阻性黄疸和顺铂引起的急性肾损伤是否有保护作用，并阐明其保护机制是否与肾脏上转运蛋白Oat1，Oat3和Mrp2的表达变化有关。
　　 方法:1急性梗阻性黄疸:大鼠随机分为正常对照组、急性梗阻性黄疸模型组、阳性药治疗组（水飞蓟素），JBP485治疗组(50mg/kg和100mg/kg)。ANIT给药48小时后，眼眶取血，测定各组大鼠血浆中胆红素(BIL)，谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)浓度，之后大鼠颈椎脱位处死取肝脏切片，通过病理切片观察肝脏的组织形态学变化;ANIT腹腔注射给药48小时后，测定模型组和空白组大鼠的JBP485血药浓度，肾排泄以及体外肾切片摄取率;分别提取各组大鼠肾组织的总RNA和蛋白，进行RT-PCR和western-blotting实验测定各组大鼠Oat1，Oat3和Mrp2的mRNA和蛋白表达。同时将各组大鼠在ANIT给药24h后，放入代谢笼中收集24h尿液，测定尿液中胆红素浓度。2急性肾损伤:按不同处理方式将大鼠分为正常对照组、模型组、JBP485治疗组。顺铂给药72小时后，眼眶取血，测定各组大鼠血浆中肌酐(creatinine)，尿素氮(BUN)和硫酸吲哚酚(indoxylsulfate，IS)的含量，之后大鼠颈椎脱位处死取肾脏，测定其丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量;模型组和空白组大鼠在腹腔注射顺铂72小时后，观察PAH血药浓度，肾排泄以及体外肾切片摄取率;顺铂造模72h后，分别提取各组大鼠肾组织的总RNA和蛋白，进行qRT-PCR，western-blotting，免疫组化和免疫荧光实验测定各组大鼠Oat1，Oat3和Mrp2的mRNA和蛋白表达。同时各组大鼠在顺铂给药48h后，放入代谢笼中收集24h尿量，测定尿液中硫酸吲哚酚浓度。
　　 结果:1急性梗阻性黄疸:(1)与正常对照组相比，急性梗阻性黄疸组:1）血浆中BIL、ALT及AST含量显著增加;2）组织形态学观察，肝组织失去原有正常组织形态而呈现出明显的病理损伤现象，表现为肝细胞水肿状、胞浆着色变浅、胞核增大、肝窦扩张且有明显的瘀血，伴有大量炎症细胞浸润及片状坏死灶;3）JBP485静脉注射后，血药浓度增高，尿累积排泄率降低，体外肾切片实验显示JBP485摄取率降低;4）肾脏Oat1和Oat3的mRNA和蛋白表达下降，Mrp2的mRNA和蛋白表达增多;(5)24h和48h累积尿液中BIL浓度显著增加。(2)与急性梗阻性黄疸组相比，JBP485治疗组:1)JBP485显著降低BIL、ALT及AST含量，效果强于阳性对照药（水飞蓟素）;2）组织形态学上观察，肝脏的受损程度明显减弱，表现为坏死面积不明显或缩小，肝细胞膨胀减轻，肝小叶边界明显，炎性细胞浸润大大减少;3）肾脏上Oat1和Mrp2的mRNA和蛋白表达均显著增多;(4)24h和48h尿累积排泄中胆红素浓度进一步增加。2.急性肾损伤:(1)与正常对照组相比，模型组:1）血浆中肌酐，尿素氮，硫酸吲哚酚浓度显著增加;2）肾小球滤过率下降;3）肾组织中MDA浓度明显升高，SOD浓度下降;4)PAH静脉注射后，血药浓度增高，累积尿排泄率降低，体外肾切片实验显示PAH摄取率降低;5）肾脏上Oat1和Oat3的mRNA和蛋白表达下降，Mrp2的mRNA和蛋白表达提高;6）免疫组化和免疫荧光显示Oat1和Oat3的表达降低;7）顺铂注射48h后，收集24h尿液，尿液中IS浓度显著增加。(2)与模型组相比，JBP485治疗组:1)JBP485显著降低血浆中creatinine、BUN及IS浓度;2）肾小球滤过率明显升高;3）肾脏组织中MDA浓度下降，SOD浓度升高;4）肾脏上Mrp2的mRNA和蛋白表达显著提高;5）免疫组化和免疫荧光显示Oat1和Oat3的表达有所恢复;6）顺铂注射48h后，收集24h尿液，尿液中IS浓度进一步增加。
　　 结论:(1)急性肝肾损伤可引起摄取类肾脏转运体Oat1和Oat3的表达和功能降低，外排类转运体Mrp2的表达和功能增加;(2)急性肝肾损伤后，肾脏Mrp2转运体表达的提高是机体的一种自我保护反应，减轻毒物蓄积;(3)JBP485可以进一步提高急性肝肾损伤状态下肾脏转运体Mrp2的表达和功能，使毒物排出增多，肝肾负担减轻，从而治疗由ANIT引起的胆道梗阻和由顺铂引起的急性肾损伤。

目录

声明

摘要

前言

第一部分：JBP485对ANIT诱导的大鼠急性梗阻性黄疸的保护作用与调节Oat1，Oat3和Mrp2的表达有关

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分：JBP485对顺铂诱导的大鼠急性肾损伤的保护作用及Oat1，Oat3和Mrp2介导的分子药代动力学机制

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

附录

研究生期间科研成果

致谢