超声微泡提高SelS基因靶向转染2型糖尿病大鼠胸主动脉效率的研究

摘要

研究背景及目的:
　　 2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)的主要死因是其合并的大血管并发症，动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是大血管病变的病理基础，氧化应激反应是触发AS的主要原因之一。硒蛋白S(Selenoprotein S，SelS)可参与氧自由基的清除，抵抗氧化应激导致的血管内皮细胞功能障碍。本研究旨在利用微泡声学造影剂(Microbubble contrast agent，MCA)与超声照射(Ultrasound exposure，UE)联合应用(MCA-UE)介导SelS基因转染T2DM-AS大鼠模型;观察SelS在T2DM-AS大鼠模型胸主动脉血管内皮细胞中表达情况;以及血清总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、C反应蛋白(CRP)、一氧化氮(NO)、血浆内皮素-1(ET-1)含量的变化;探讨基因转染后内皮细胞SelS表达丰度与基因转染剂量及时间的关系，为深入研究SelS的功能提供实验依据，并探求防治T2DM及大血管病变的研究新策略。
　　 方法:
　　 1.微泡复合体的制备:通过抗生物素蛋白-生物素多级桥接化学法将抗生物素蛋白链菌素及生物素化VCAM-1单克隆抗体逐步结合到微泡外壳，制备携带目的基因SelS的靶向超声微泡复合体。
　　 2.购买8周龄健康雄性SD大鼠(体重180～200g)140只，随机分为正常对照组（10只，普通饲料喂养，NC组）、T2DM-高脂喂养转染组（120只，TR组）、T2DM-高脂喂养未转染组（10只，NTR组）;其中TR组按照不同的转染质粒剂量（50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg）、转染至处死大鼠的天数不同（1天、3天、5天、7天）分为12个亚组（每个亚组10只），分别设为TR50-1、TR50-3、TR50-5、TR50-7、TR100-1、TR100-3、TR100-5、TR100-7、TR200-1、TR200-3、 TR200-5、TR200-7组。
　　 3.高糖高脂饲料喂养4周后，腹腔注射链脲佐菌素(STZ)30mg/kg制备2型糖尿病模型，其后应用维生素D3注射液60万U/kg腹腔注射（总剂量平均分3次注射，糖尿病成模后前3周每周1次），高糖高脂饲料喂养共16周。25周龄时将TR组进行基因转染处理，将制备的靶向超声微泡复合体尾静脉注射(NC组及NTR组作为阴性对照，尾静脉注射等体积生理盐水及MMV混合液体)，基因转染治疗仪辐照胸主动脉体表投影区。TR组于转染后第1天、3天、5天及7天(NC组及NTR组于转染后第1天)分别处死，留取血清及胸主动脉，测定血脂、血清SAA、CRP、NO及血浆ET-1含量;提取大鼠胸主动脉总RNA及总蛋白，以Real-timePCR方法检测SelSmRNA水平的表达，Western blot方法检测SelS蛋白水平的表达;将大鼠胸主动脉组织0.5cm固定于10％中性福尔马林溶液中，行常规HE染色评价T2DM-AS成模情况。
　　 结果:
　　 1.成功制备微泡复合体，静置状态下上层为白色混浊状，下层为较清液体。普通显微镜下可见呈圆形泡状结构，应用荧光显微镜对微泡复合体进行定性鉴定，在圆形微泡周围可见绿色荧光。
　　 2.成功建立T2DM-AS模型: NTR组体重、血糖均高于NC组（P＜0.05）。镜下可见NC组胸主动脉内皮光滑，无纤维增生及脂纹形成;NTR及TR组组胸主动脉的平滑肌细胞核变大、变圆，细胞变短，向内皮迁移，内皮细胞聚集变形，形成纤维帽;内膜可见针尖大小裂隙，中膜层结构疏松，弹力纤维增生，成玻璃样变，形成脂纹。上述病理改变提示，NTR组及TR组大鼠已形成动脉粥样硬化。
　　 3.SelS表达丰度及时效研究结果:各组大鼠胸主动脉均有SelS的mRNA表达，TR50-5组、TR100-5组、TR200-3组是对应各转染剂量组表达量最高的三组，其中TR50-5＞TR100-5组＞TR200-3组;TR100-5组SelS蛋白表达量较NC组及NTR组上调（P＜0.05），其余TR组的SelS蛋白表达量与NC组及NTR组相比均无统计学意义。TR100-5组SelS mRNA和蛋白的表达丰度最高。
　　 4.血脂、血清SAA、CRP、NO及血浆ET-1的测定结果: NTR组及TR100-5组大鼠的血脂(TC、TG、LDL-C)及血清NO较NC组均明显升高（P＜0.05），但NTR组与TR100-5组大鼠之间的血脂、NO水平无明显差异（P＞0.05）。NTR组及TR100-5组大鼠血清SAA、CRP及血浆ET-1的水平均较NC组明显升高(P＜0.05)，经单次尾静脉注射SMMV联合超声辐照转染SelS后，可以明显降低大鼠血清SAA、CRP及血浆ET-1的水平（TR100-5组较NTR组降低，P＜0.05）。
　　 结论:
　　 1.超声微泡可以提高SelS基因靶向转染2型糖尿病大鼠胸主动脉的效率，其作用与转染质粒的剂量及时间有关。当转染质粒剂量为100μg/kg，转染第5天时体内SelS表达量达最佳，时效为1周。
　　 2.以质粒剂量100μg/kg进行转染5天后，ET-1的水平降低，内皮功能可能有所改善，同时伴有炎症因子水平的降低。提示SelS基因的转染可以发挥一定的内皮保护作用，这种作用可能与其下调炎症因子水平有关。

目录

声明

摘要

前言

材料和方法

一、主要试剂

二、主要仪器

三、相关引物和抗体

四、方法

五、统计学处理

结果

一、显微镜下观察微泡及其表面结合VCAM-1一抗的定性鉴定

二、糖尿病性动脉粥样硬化大鼠(T2DM-AS)模型的制备情况

三、超声微泡介导SelS给基因大鼠体内转染

四、SelS表达时效研究结果

五、转染SelS对大鼠血清学指标的影响

讨论

结论

参考文献

综述

附录

致谢