榄香烯联合丝裂霉素C诱导免疫原性细胞死亡及机制研究

摘要

目的:
　　 榄香烯复合瘤苗(elemenecombotumorcellvaccine，EC-TCV)是用榄香烯和丝裂霉素C(MitomycinC，MMC)联合处理肿瘤细胞制备的细胞水平的瘤苗。用EC-TCV免疫可诱导人和小鼠产生较强的抗瘤免疫。本实验探讨了免疫原性细胞死亡和剪接体相关蛋白62(spliceosomeassociatedprotein62，SAP62)在增强榄香烯复合瘤苗免疫原性中的作用。
　　 方法:
　　 1.榄香烯复合瘤苗制备:Hca-F是小鼠肝癌H22的高淋巴道转移亚系。无菌制备Hca-F单细胞悬液，分成四组:①榄香烯复合瘤苗组:用榄香烯和丝裂霉素C联合处理Hca-F细胞，细胞蓝染率为(65±3)％;②对照组:不加任何药物;③榄香烯组:单用榄香烯处理;④丝裂霉素C组:单用丝裂霉素C处理。上述药物的终浓度均为50μg/mL，处理时间都为3h。
　　 2.榄香烯复合瘤苗免疫预防实验:取健康Balb/c(SPF)小鼠分成3组，每组10只，雌雄各半。①瘤苗免疫组:于右腋皮下接种榄香烯复合瘤苗0.2mL(5×107/mL)3次，间隔6天。②攻击对照组:腹腔注射生理盐水0.2mL，③联用细胞因子组(EC-TCV+CKs):接种榄香烯复合瘤苗同时腹腔注射0.1μgGM-CSF+0.1μgIL-4，所有小鼠在末次免疫后10天（记为攻击后第0天）于左腋下接种Hca-F细胞1×106/只。观察肿瘤生长情况和生存时间。ELISA试剂盒检测小鼠血清中IFN-λ3。
　　 3.MTT法测细胞增殖，用DAPI染色法和吉姆萨染色法观察细胞的形态变化情况，Westemblot法检测Hca-F细胞中SAP62的变化，用SPSS统计软件进行分析。P＜0.05为差异有显著性。
　　 结果:
　　 1.EC-TCV的免疫保护效应:EC-TCV免疫后瘤苗注射部位未见肿瘤。肿瘤接种后第15日起，对攻击照组肿瘤体积为1.22cm3，EC-TCV免疫组为0.24cm3，EC-TCV+CKs组为0.34cm3，与攻击对照组比较，肿瘤体积的差异均有显著性(P＜0.05)，两实验组间差异无统计学意义(P＞0.05)。攻击对照组的小鼠到第43-天全部死亡，EC-TCV免疫组和EC-TCV+CKs组分别有7/10和6/10只小鼠存活时间超过60天。正常对照组小鼠血清IFN-λ3浓度为(14.12±9.20)pg/mL，攻击对照组小鼠为(19.32±9.76)pg/mL和瘤苗免疫组小鼠血清IFN-λ3为(24.72±19.7)pg/mL水平增加，但差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 2.Hca-F细胞的增殖和死亡变化:MTT法测细胞增殖抑制率:榄香烯、丝裂霉素C单用或联合均能抑制Hca-F细胞增殖，与不加药组比较，差异具有显著性(P＜0.05)。DAPI染色和吉姆萨染色的结果显示EC-TCV组可见具有凋亡特征和坏死特征的细胞。
　　 3.SAP62表达的变化:Westemblot的结果表明各组Hca-F细胞都表达SAP62，榄香烯和丝裂霉素C下调SAP62表达，EC-TCV组的表达量是最低的。与对照组比较差异有显著性(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 1.榄香烯复合瘤苗能够诱导小鼠产生对MHC-I-H22肝癌的高淋巴道转移亚系Hca-F的免疫应答，GM-CSF与IL-4不能明显增强榄香烯复合瘤苗的主动免疫保护效应，诱导IFN-九3产生不是EC-TCV主要作用机制。
　　 2.榄香烯复合瘤苗细胞中观察到的细胞死亡具有免疫原性细胞死亡的特征，是榄香烯复合瘤苗肿瘤免疫原性增强的机制之一。
　　 3.榄香烯和丝裂霉素C联合处理导致肿瘤细胞SAP62表达下降，藉此影响mRNA成熟和选择性剪接而发挥抗肿瘤作用。

目录

声明

摘要

前言

材料

1．1 实验动物、瘤株

1．2 实验用材(药品、试剂等)

1．3 主要仪器

方法

2．1 小鼠腹水型肝癌Hca-F细胞复苏与传代

2．2 榄香烯复合瘤苗的制备

2．3 榄香烯复合瘤苗免疫预防实验

2．4 ELISA试剂盒检测小鼠血清中IFN-λ3的分泌

2．5 MTT法测化疗药体外对Hca-F细胞增殖

2．6 DAPI法和吉姆萨染色法观察化疗药处理肿瘤细胞后细胞的形态变化情况

2．7 Western blot法测不同药物处理的Hea-F细胞中SAP62的变化

2．8 统计学处理实验数据

结果

1．榄香烯复合瘤苗的免疫保护效应

2 不同处理组中血清IFN-λ3的分泌

3 Hca-F细胞的存活和死亡变化

4 不同药物处理后，SAP62表达的变化

讨论

结论

参考文献

综述

致谢