耻垢分枝杆菌MSMEG-6402基因的克隆、表达及功能鉴定

摘要

结核病(Tuberculosis，TB)主要是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的，多种耐药性结核菌株的出现以及临床抗结核药物的缺乏，致使结核病发病率呈逐年上升趋势，寻找新的药物靶点、开发能有效治疗多重耐药结核的抗结核药物亟待解决。
　　 细胞壁是分枝杆菌赖以生存的重要屏障，而聚阿拉伯糖是细胞壁的核心组分。聚阿拉伯糖基的活性供体被证实是聚十异戊二烯磷酸阿拉伯糖（Decaprenyl-phospho-arabinose，DPA）。近几年，随着磷酸核糖转移酶(Rv3806c)和差向异构酶（Rv3790/Rv3791）功能的揭示，DPA特异的合成途径逐渐被阐明，是由三个连续反应组成:(1)Rv3806c催化5-磷酸核糖焦磷酸（PRPP）转移到聚十异戊二烯磷酸(DP)分子上形成5-磷酸核糖聚十异戊二烯磷酸(5-P-DPR);(2)磷酸酶催化5-P-DPR分子上的5-磷酸基团水解形成聚十异戊二烯磷酸核糖(DPR);(3)Rv3790/Rv3791催化DPR生成DPA。在此途径中，催化5-P-DPR脱磷酸的磷酸酶尚未被鉴定。而与Rv3806c处于同一启动子的Rv3807c通过蛋白结构域预测具有磷酸酶功能结构域，该蛋白被推测催化5-P-DPR生成了DPR。非致病菌耻垢分枝杆菌的MSMEG-6402基因是Rv3807c基因的同源基因，本论文通过在大肠杆菌BL21(DE3)中将MSMEG-6402基因克隆、可溶性表达并纯化，建立MSMEG-6402蛋白的体外酶活测定方法，对MSMEG_6402的功能进行阐明，这将有助于完善对于DPA合成代谢途径的认识以及寻找新型抗结核药物靶点。
　　 本研究的实验内容包括:1）构建pET16b-MSMEG-6402表达质粒，在BL21(DE3)中进行可溶性表达，并用镍-组氨酸亲和层析法对带有N-末端组氨酸标签的MSMEG-6402蛋白进行纯化，通过SDS-PAGE和Western-blotting对表达蛋白和纯化蛋白进行检测鉴定;2）由于5-P-DPR反应直接底物的缺乏，需要偶联Rv3806c参与的酶促反应来完成酶活检测，因此我们采用与MSMEG-6402相同的表达载体和菌株对Rv3806c蛋白进行可溶性表达并纯化，通过SDS-PAGE和Western-blotting进行检测鉴定;3）根据底物DP/PRPP和产物DPPR/DPR的性质及其消耗产出量的变化，分别采用孔雀石绿-钼酸铵测磷法、薄板层析法(TLC)以及质谱法(MS)对MSMEG-6402纯化蛋白的功能活性进行检测。
　　 研究结果如下:
　　 1)成功对MSMEG-6402基因和Rv3806c基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行可溶性表达，通过Ni-NTA纯化获得目的蛋白，分子量分别为20kDa和33kDa;
　　 2)建立MSMEG-6402蛋白功能活性的测定方法，对其磷酸酶活性进行鉴定:孔雀石绿-钼酸铵测磷法对反应生成的游离单磷酸进行检测，观察到MSMEG-6402蛋白参与的反应组明显的颜色和OD630值变化，阴性对照组与空白对照组结果相近;TLC法对反应产物DPPR和DPR进行检测，由于二者均为糖脂化合物，同时采用糖显色和脂显色，以DP和PRPP为底物对照，样品组有DPPR和DPR的生成，而阴性对照组只有DPPR的生成;MS法对底物DP/PRPP的消耗量和产物DPPR/DPR的生成量进行直接检测，结果显示DP/PRPP有一定量的消耗，同时DPPR/DPR有相应的峰出现。
　　 综上所述，本研究利用不同的方法对MSMEG-6402蛋白的功能进行了阐明，鉴定了其特异的磷酸酶活性，催化5-P-DPR生成DPR，进一步完善了DPA的合成代谢途径，在今后的研究工作中，我们将改善对MSMEG-6402蛋白的纯化方法，减少杂蛋白的含量，体外模拟DPA的合成通路，对MSMEG-6402蛋白在代谢网络中扮演的角色进一步阐述。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

一．材料

二．实验方法

结果

1．MSMEG-6402基因的克隆

2．MSMEG-6402蛋白和Rv3806c蛋白在E．coliBL21(DE3)中的可溶性表达

3．MSMEG-6402蛋白和Rv3806c蛋白的纯化及检测

4．MSMEG-6402蛋白的磷酸酶功能活性鉴定

讨论

结论

未来工作

参考文献

综述

致谢