NLRP3炎症小体及其下游炎症因子在动脉粥样硬化炎症反应中的作用

摘要

背景:目前冠心病(CAD)已成为发达国家患者死亡的首要原因。以血管壁功能紊乱及斑块形成为特征的动脉粥样硬化是冠心病形成及发展的主要病理过程。内皮功能紊乱引起的自由基增加，低密度脂蛋白(LDL)、感染性微生物、剪切应力、毒素、高血压等因素的共同作用会诱导慢性炎症反应的发生最终导致动脉粥样硬化的形成。慢性炎症反应是动脉粥样硬化发生发展过程中的重要推动力，动脉壁的脂质沉积以及外周血炎性细胞的浸润被认为是动脉粥样硬化斑块形成及发展的主要标志。
　　 近年来的研究提示先天免疫模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)介导的炎症反应在动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥了重要作用。它们通过识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)以及内源性危险信号(endogenous danger signals，DAMPs)使免疫细胞受到活化并分泌一系列的细胞因子从而促进动脉壁的炎症反应过程。NLRP3炎症小体是刚刚引起关注的一种细胞内模式识别受体，当配体与NLRP3结合后促进炎症小体的形成，并对caspase-1进行自身激活，最终导致IL-1β和IL-18的成熟及分泌。现有研究结果提示NLRP3炎症小体可能参与了动脉粥样硬化炎症反应的发生，但是部分研究结论仍然存在矛盾。因此，清楚认识NLRP3炎症小体及其下游炎症因子在动脉粥样硬化中的作用，对于认识细胞内模式识别受体在人动脉粥样硬化形成及发展中的作用具有重要意义。
　　 方法:该实验主要分为两大部分:第一部分观察临床冠心病患者外周血单核细胞内NLRP3炎症小体及其下游炎症因子的表达情况。通过ELISA，real-time PCR和Western Blot等方法对20例健康对照以及64例不同程度冠心病(稳定性心绞痛，不稳定性心绞痛)患者外周血单核细胞NLRP3及其下游炎症因子的mRNA和蛋白表达水平进行检测;观察30例急性ST段抬高型心肌梗死患者NLRP3炎症小体及其下游炎症因子的动态表达，共选取4个时间点依次为:胸痛发作6小时以内，胸痛发作后48～72小时，心肌梗死发病后1周以及心肌梗死后4～6周，通过ELISA，real-time PCR的方法对急性ST段抬高型心肌梗死患者发病不同时间点的外周血单核细胞内NLRP3及其下游炎症因子的表达进行观察。第二部分，从细胞水平探讨NLRP3炎症小体的作用，采用ox-LDL、ox-HDL、HDL三种脂蛋白分别作用于人单核细胞系Thp-1之后，观察NLRP3及其下游炎症因子的表达变化;通过RNA干扰技术，构建NLRP3小干扰RNA下调NLRP3基因表达，再次给予ox-LDL、ox-HDL、HDL，观察下调NLRP3基因表达后对下游caspase-1、IL-1β和IL-18活化情况的影响;观察人脐静脉内皮细胞系ECV304中是否存在NLRP3及其下游炎症因子的表达，同样给予ox-LDL、ox-HDL、HDL作用后观察NLRP3及其下游炎症因子的表达变化。
　　 结果:
　　 1.NLRP3及其下游炎症因子在冠心病患者中随冠心病的病情及冠状动脉粥样硬化的严重程度增加而表达逐渐增加;
　　 2.NLRP3及其下游炎症因子在急性ST段抬高型心肌梗死发病过程中的4个时间点:胸痛发作6小时以内(3.5±1.1小时)，胸痛发作后48～72小时(57.0±9.4小时)，心肌梗死发病后1周(7±1天)以及心肌梗死后4～6周(5.1±0.7周)具有动态变化;
　　 3.氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)，氧化高密度脂蛋白(ox-HDL)作用于单核细胞后可以促进NLRP3表达，并进一步活化NLRP3炎症小体下游的caspase-1，诱发IL-1β和IL-18的分泌，这种活化效应具有浓度依赖性;高密度脂蛋白(HDL)作用于单核细胞随作用浓度的升高NLRP3及其下游炎症因子的表达逐渐减弱;干预NLRP3炎症小体能够明显抑制细胞因子的产生;
　　 4.在人脐静脉内皮细胞系ECV304中存在NLRP3及其下游炎症因子的mRNA和蛋白水平的表达;给予氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)和氧化高密度脂蛋白(ox-HDL)刺激后，能够促进NLRP3及其下游炎症因子的mRNA和蛋白水平的表达，促进炎症介质IL-1β和IL-18的释放。
　　 结论:
　　 1.NLRP3及其下游炎症因子在冠心病患者中随冠心病的病情及冠状动脉粥样硬化的严重程度增加而表达逐渐增加，提示NLRP3及其下游炎症因子可能与冠心病的病情及动脉粥样硬化病变严重程度相关;
　　 2.NLRP3及其下游炎症因子在急性ST段抬高型心肌梗死发病过程中具有动态变化，提示NLRP3及其下游炎症因子可能参与了急性ST段抬高型心肌梗死发病过程中的急性炎症反应;
　　 3.在人单核细胞和内皮细胞中都存在NLRP3及其下游炎症因子的表达，在脂蛋白的作用下能够表现出不同程度的活化和抑制作用，干预NLRP3炎症小体能够明显抑制细胞因子的产生，提示NLRP3炎症小体在参与动脉粥样硬化发生发展的多种细胞内表达，诱导炎症介质的释放，能够全面参与动脉粥样硬化发生发展过程中的炎症反应，干预NLRP3有可能成为防治动脉粥样硬化新的靶点。

目录

声明

摘要

第一部分 NLRP3炎症小体及其下游炎症因子在冠心病患者外周血单核细胞中的表达

前言

材料和方法

1．实验材料

2．主要试剂

3．试验方法

4．统计分析

结果

1．NLRP3及其下游炎症因子在不同程度冠心病患者中的表达

2．急性ST段抬高型心肌梗死发病不同时间点NLRP3及其下游炎症因子的表达情况

3．相关性及多元回归分析

讨论

小结

参考文献

第二部分 NLRP3炎症小体在动脉粥样硬化中的作用

前言

材料和方法

1．实验材料

2．主要试剂及仪器

3．试验方法

4．统计学分析

结果

1．氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、氧化高密度脂蛋白(ox-HDL)、高密度脂蛋白(HDL)诱导下人单核中NLRP3及其下游炎症因子的表达变化

2．NLRP3 siRNA干扰对单核细胞内NLRP3及其下游caspase-1、IL-1β和IL-18表达变化的影响

3．氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、氧化高密度脂蛋白(ox-HDL)、高密度脂蛋白(HDL)诱导下人脐静脉内皮细胞中NLRP3及其下游炎症因子的表达变化

讨论

小结

参考文献

综述

攻读学位期间发表论文情况

致谢