NLRP3炎症小体在重金属毒物暴露致炎症反应中的作用及机制研究

摘要

研究背景：
　　NLRP3炎症小体是一种细胞内蛋白复合体，具有调控机体免疫反应，抵抗病原微生物感染和细胞损伤，维持细胞自身稳态的功能。在多种病原，颗粒物和损伤的作用下，NLRP3炎症小体的组装和活化可触发自身水解procaspase-1为活性的caspase-1，进而剪切pro-IL-1β和pro-IL-18成熟和分泌，诱导机体的炎症反应。过度的炎症反应引起免疫功能失调，造成细胞和组织损伤，与多种炎性疾病发生和发展密切相关。
　　纳米氧化镍颗粒是一种代表性的金属纳米材料，已广泛用于制造催化剂、能量储存装置、传感器、关节移植物以及药物递送系统等领域。日益增加的纳米氧化镍的生产和应用，极大的增加了环境和人体暴露的机会，由此带来的环境污染和健康危害已引起人们高度关注和普遍担忧。镉是一种工业和环境重金属污染物，镉污染和危害防治已成为毒理学和环境医学领域的热点和重点问题。
　　异常的炎症反应是重金属引起细胞组织损伤的重要环节。本研究以NLRP3炎症小体激活为切入点，明确纳米氧化镍致肺损伤和镉引起肝毒性的效应，探讨NLRP3炎症小体活化在重金属致炎症反应中的作用和机制以及褪黑素的防护效应。
　　研究内容：
　　(1)以SD大鼠经气管滴注暴露纳米氧化镍为模型，检测纳米氧化镍暴露对肺泡灌洗中细胞数量、总蛋白含量、LDH释放和碱性磷酸酶活性的影响。检测和评价肺组织病理学改变以及NLRP3炎症小体的激活情况，明确纳米氧化镍致肺损伤和炎症的效应。
　　(2)以小鼠巨噬细胞RAW264.7和人支气管上皮BEAS-2B细胞为模型，检测纳米氧化镍的吞噬和摄取，并以CCK-8细胞活力实验和LDH乳酸脱氢酶释放实验评估纳米氧化镍的细胞毒性。同时，检测纳米氧化镍在细胞中的定位以及对溶酶体功能的影响。应用质子泵ATP酶抑制剂Baf A1和组织蛋白酶B抑制剂CA-074Me处理细胞，检测细胞炎性因子释放和NLRP3炎症小体激活的情况，明确溶酶体损伤和组织蛋白酶B释放在纳米氧化镍致细胞损伤和NLRP3炎症小体活化中的作用。
　　(3)以小鼠原代肝细胞为模型，检测和评估镉暴露致肝毒性效应。应用具有抗氧化和抗炎作用的褪黑素预处理肝细胞，检测肝细胞活力，LDH释放，ROS生成以及炎性细胞死亡情况，明确褪黑素对镉肝细胞毒性的保护作用。同时，检测镉暴露及褪黑素预处理对TXNIP的表达和NLRP3炎症小体活化的影响，探讨褪黑素保护镉肝细胞毒性的可能机制。应用siRNA下调肝细胞中TXNIP表达，检测褪黑素对镉暴露所致NLRP3炎症小体活化的影响，明确TXNIP/NLRP3信号通路在褪黑素拮抗镉肝细胞毒性效应中的作用。
　　研究结果：
　　(1)3.3 mg/kg剂量的纳米氧化镍经气管暴露引起SD大鼠明显的肺损伤和持续的炎症反应，表现为肺泡灌洗液内中性粒细胞数量增多，碱性磷酸酶活性增高，LDH和总蛋白含量增加，肺组织中炎性细胞浸润、蛋白沉积和炎性因子表达上调。纳米氧化镍暴露能引起肺组织中NLRP3炎症小体的活化。
　　(2)纳米氧化镍能被RAW264.7细胞和BEAS-2B细胞吞噬摄取，并引起剂量和时间依赖的细胞毒性效应。纳米氧化镍暴露促进细胞释放大量的炎症因子和引起NLRP3炎症小体介导的caspase-1活化。下调NLRP3表达和抑制caspase-1的活性可以减少IL-1β的释放。运用cytochalasin D抑制细胞吞噬可以降低纳米氧化镍引起的细胞毒性，抑制NLRP3炎症小体活化和IL-1β的释放。纳米氧化镍被细胞摄取和转运至溶酶体，导致溶酶体蛋白水解能力下降，pH值增高，溶酶体通透性增加和组织蛋白酶B的释放。抑制溶酶体酸化和组织蛋白酶B的释放可以显著抑制纳米氧化镍引起的caspase-1活化和IL-1β的释放。
　　(3)镉暴露引起明显肝细胞毒性，且呈时间依赖关系。褪黑素预处理可通过抑制ROS生成、下调TXNIP表达和抑制NLRP3炎症小体激活来拮抗镉诱导的肝细胞毒性。siRNA干扰TXNIP的表达可以有效逆转褪黑素的保护效应，表明对TXNIP/NLRP3信号通路的抑制作用可能是褪黑素发挥抗氧化和抗炎作用的基础。
　　研究结论：
　　纳米氧化镍暴露通过激活NLRP3炎症小体引起肺损伤和持续的炎症反应。吞噬和摄取的纳米氧化镍通过引起溶酶体酸化和增加溶酶体膜通透性，引起组织蛋白酶B的释放，进而激活NLRP3炎症小体，最终导致炎症反应和细胞组织损伤。同时，我们研究发现褪黑素预处理对重金属镉暴露所致的肝细胞毒性和TXNIP/NLRP3信号通路激活具有保护作用，提示褪黑素可作为拮抗重金属毒物暴露致炎症反应的备选药物。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 纳米氧化镍激活NLRP3炎症小体引起肺部炎症

2．1 引言

2．2 技术路线图

2．3 材料与方法

2．4 实验结果

2．5 讨论

2．6 小结

第三章 纳米氧化镍激活NLRP3炎症小体的相关机制研究

3．1 引言

3．2 技术路线图

3．3 材料与方法

3．4 实验结果

3．5 讨论

3．6 小结

第四章 褪黑索拮抗重金属毒物的致炎效应及机制研究

4．1 引言

4．2 技术路线图

4．3 材料与方法

4．4 实验结果

4．5 讨论

4．6 小结

全文总结

参考文献

文献综述 NLRP3炎症小体活化和调控机制

博士在读期间发表的论文

致谢