重症急性胰腺炎SIRS大鼠中性粒细胞的钙稳态变化及大黄素的调节作用

摘要

背景和目的:
　　 重症急性胰腺炎(severeacutepancreatitis，SAP)是一种发病急、进展快、并发症多、病死率高的临床严重疾病。全身炎性反应综合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)是SAP发展至多器官功能障碍综合征（multipleorgansdysfunctionsyndrome，MODS）的前期表现，是其高病死率的主要原因。过度的炎性反应可导致机体免疫功能下降，器官感染、功能受损等，进而导致并发症发生率明显升高[1,2]，进一步加重SAP病情的发展，形成恶性循环。因此，阻断SIRS向MODS的进展是降低SAP高病死率的关键。多形核中性粒细胞（polymorphonuclearneutrophils，PMN），是炎症反应的重要效应细胞，在炎症的发生、发展和转归中起着关键的作用[3]。PMN凋亡障碍或延迟是SIRS的主要病理生理过程。钙离子作为人体内最普遍的信号转导因子之一，调节着许多细胞和组织的生理活动，其稳态失衡是细胞凋亡的关键环节之一。
　　 本实验旨在SAP所致的SIRS大鼠模型中，研究PMN细胞内及线粒体内钙离子浓度变化，并进一步探讨大黄素(Emodin)和地塞米松（Dexamethasone）对其的影响及作用机制，以确定钙稳态是否为大黄素和地塞米松的治疗靶点，为其临床治疗SAP提供理论依据。
　　 方法:
　　 采用经十二指肠乳头逆行胆胰管注射1.5％脱氧胆酸钠溶液的方法制备重症急性胰腺炎SIRS大鼠模型。
　　 第一阶段:分组及模型制备:将健康SD大鼠随机分组，即A组（假手术组）、B组（重症急性胰腺炎SIRS模型对照组）、C组（Emodin干预组:C1组干预终浓度为1ug/ml;C2组干预终浓度为5ug/ml;C3组干预终浓度为10ug/ml），每组10只;体外干预实验:造模24小时后，采取外周血分离中性粒细胞，然后根据实验要求分别进行药物干预，A组（生理盐水）、B组（生理盐水）、C1（Emodin干预终浓度为1ug/ml）、C2（Emodin干预终浓度为5ug/ml）、C3(Emodin干预终浓度为10ug/ml)。收集药物干预24小时后的PMN，检测各组的PMN凋亡率。
　　 第二阶段:分组及模型制备:将健康SD大鼠随机分为5组，即假手术组(SO组)，重症急性胰腺炎SIRS模型对照组（MCO组）、地塞米松干预组（DEX组）、Emodin干预组（EMD组，干预终浓度5ug/ml，由第一阶段结果确定）、Emodin联合地塞米松干预组（EAD组），每组20只（后四组统称为重症胰腺炎SIRS模型组---SAP.SIRS组）。体外干预实验:造模24小时后，将SO组外周血分离的PMN分为2份，即假手术对照组（SOC组）和假手术钙拮抗组（SOCA组），然后根据实验要求分别进行药物干预，SOC组（生理盐水）、SOCA组（拉西地平干预终浓度1μg/L，乙醇终浓度＜0.2％）、MCO组（生理盐水）、DEX组（干预终浓度为0.1umol/ml）、EMD组（干预终浓度为5ug/ml，乙醇终浓度＜0.1％）、EAD组。收集药物干预24小时后的PMN，检测各组PMN凋亡率及细胞内和线粒体内钙离子浓度变化。
　　 结果:
　　 第一阶段:各组PMN凋亡百分率检测结果显示，A组PMN凋亡百分率明显高于B组(P＜0.01);C1组、C2组PMN凋亡百分率均高于B组(P＜0.01)，其中C2组PMN凋亡百分率明显高于C1组(P＜0.05);C3组PMN基本处于晚期凋亡或继发坏死象限。
　　 第二阶段:
　　 1、应用流式细胞技术检测各组PMN凋亡百分率
　　 (1)SO组:SOCA组细胞凋亡百分率明显低于SOC组(P＜0.01)。
　　 (2)SAP.SIRS组:DEX组、EMD组、EAD组细胞凋亡百分率均高于MCO组(P＜0.05)，其中DEX组升高程度最小;EMD组、EAD组细胞凋亡百分率均高于DEX组(P＜0.05):EMD组与EAD组两组相比较没有显著性差异（P＞0.05）。
　　 (3)SO组与SAESIRS组:MCO组细胞凋亡百分率明显低于SOC组(P＜0.01);EMD组、EAD组细胞凋亡百分率均高于SOC组(P＜0.05);DEX组细胞凋亡百分率低于SOC组（P＜0.05）。
　　 2、应用激光扫描共聚焦显微镜检测PMN胞内钙离子浓度变化
　　 (1)SO组:SOCA组细胞内钙离子浓度明显低于SOC组(P＜0.01)。
　　 (2)SAESIRS组:DEX组、EMD组、EAD组三组细胞内钙离子浓度较MCO组均有不同程度的升高(P＜0.05)，其中DEX组升高程度最小;EMD组、EAD组两组细胞内钙离子浓度均高于DEX组(P＜0.05);EMD组与EAD组两组相比较没有显著性差异（P＞0.05）。
　　 (3)SO组与SAP.SIRS组:MCO组细胞内钙离子浓度明显低于SOC组(P＜0.01);EMD组、EAD组细胞内钙离子浓度均高于SOC组(P＜0.05);DEX组细胞内钙离子浓度低于SOC组(P＜0.05)。
　　 3、应用激光扫描共聚焦显微镜检测PMN线粒体内钙离子浓度变化
　　 (1)SO组:SOCA组线粒体内钙离子浓度明显低于SOC组（P＜0.01）。
　　 (2)SAP.SIRS组:DEX组、EMD组、EAD组三组线粒体内钙离子浓度较MCO组均有不同程度的升高(P＜0.05)，其中DEX组升高程度最小;EMD组、EAD组两组线粒体内钙离子浓度均高于DEX组（P＜0.05）;EMD组与EAD组两组相比较没有显著性差异（P＞0.05）。
　　 (3)SO组与SAP.SIRS组:MCO组线粒体内钙离子浓度明显低于SOC组(P＜0.01);EMD组、EAD组线粒体内钙离子浓度均高于SOC组(P＜0.05);DEX组线粒体内钙离子浓度低于SOC组(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 重症急性胰腺炎SIRS大鼠模型的PMN凋亡率明显低于正常大鼠，可能与PMN钙稳态失衡有关;Emodin能通过增加PMN胞内及线粒体内钙离子浓度，促进重症急性胰腺炎SIRS的PMN凋亡，抑制其凋亡延迟;地塞米松虽可增加SIRS外周血PMN胞内及线粒体内钙离子浓度，促进PMN凋亡，但效果不如Emodin;二者联合应用时，未显示出协同作用。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1．材料

1．1 实验对象与分组

1．2 主要仪器与设备

1．3 主要试剂及药品

1．4 主要试剂的配制

2．实验方法

2．1 第一阶段

2．2 第二阶段

3．统计学处理

4．实验流程图

结果

1．第一阶段

1．1 SD大鼠造模后的表现和生命体征

1．2 大体解剖观察

1．3 光镜下胰腺组织病理学改变

1．4 各组PMN凋亡率比较

2 第二阶段

2．1 各组PMN凋亡率比较

2．2 各组PMN胞内钙离子浓度比较

2．3 各组PMN线粒体内钙离子浓度比较

2．4 PMN凋亡率、细胞内钙离子浓度和线粒体内钙离子浓度的相关性分析

讨论

1．重症急性胰腺炎SIRS时PMN凋亡与钙稳态的关系

1．1 SAP与SIRS、PMN凋亡的关系

1．2 钙稳态失调与SAP外周血PMN凋亡线粒体途径

2．大黄素及地塞米松对重症急性胰腺炎SIRS外周血中性粒细胞的体外作用和作用机制探讨

2．1 大黄素对重症急性胰腺炎SIRS外周血PMN的体外作用及可能作用机制

2．2 地塞米松治疗对重症急性胰腺炎SIRS外周血PMN的体外作用及可能作用机制

2．3 大黄素联合地塞米松对重症急性胰腺炎SIRS外周血PMN的体外作用及可能作用机制

结论

参考文献

综述

附录

致谢