IgA介导的通过中性粒细胞的CD47-SIRPα检查点抑制对异常细胞的杀伤

摘要

本发明提供了用于刺激中性粒细胞介导的对表达CD47的细胞的杀伤的手段和方法。方法可以包括在存在第一结合部分和第二结合部分的情况下，使中性粒细胞与表达CD47和另一种细胞外膜结合抗原的细胞接触，其中所述第一结合部分特异性地结合髓样IgA受体(CD89)和所述抗原，并且其中所述第二结合部分特异性地结合CD47和/或SIRPα并阻断所述中性粒细胞中CD47介导的SIRPα信号传导。

说明书

本发明涉及抗体领域，特别是涉及治疗性抗体的领域。本发明还涉及免疫治疗领域，特别是涉及减少癌症中的免疫应答抑制过程。

近年来，癌症治疗已经有了很大发展。目前许多实验性和常规治疗包括施用一种或更多种针对肿瘤细胞和/或免疫细胞的抗体。此类抗体本身、由于抗体药物缀合物，或者由于免疫系统被刺激或较少被抑制来对抗肿瘤细胞而是溶解性的(lytic)。癌症的抗体治疗包括曲妥珠单抗、西妥昔单抗和利妥昔单抗，它们分别靶向HER2/neu、EGFR或CD20。所有FDA批准的抗体药物都是IgG同种型。然而，IgA同种型的抗体已被示出在体外和体内对肿瘤有效(例如，Boross等人,2013EMBO Mol Med 5:1213-26)。IgG通常与血流有关，而IgA主要以其分泌方面和其以二聚体形式在粘膜部位的存在而为人所知。IgA包括两个亚类，IgA1和IgA2。两种IgA类型均以相似的亲和力结合髓样IgA受体(FcαRI，CD89)。分泌形式不被受体结合。

抗体的免疫介导效应包括补体活化诱导的细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。ADCC可以通过活化不同的表达Fc受体的细胞，包括自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和中性粒细胞来介导。巨噬细胞和中性粒细胞表达结合IgA抗体的CD89受体，并且可以如说明的通过ADCP或ADCC杀死肿瘤细胞。IgA类的抗体已经示出了诱导各种肿瘤靶的ADCC，包括HER2/neu+-癌和EGFR+-癌和CD20阳性淋巴瘤的结果。

目前已知多种检查点抑制分子。研究了它们中的大多数以观察它们是否可以在逆转免疫应答抑制疗法中起作用。抑制性受体信号调节蛋白α(SIRPα)或其配体CD47在临床前模型中当与IgG1和IgG2抗癌疗法组合时有效(Zhao,Proc Natl Acad Sci U S A.2011；108(45):18342-7；Matlung等人,Immunol Rev.2017；276(1):145-64；Chao等人,Cell.2010；142(5):699-713；Weiskopf等人,Science.2013；341(6141):88-91；Treffers等人Eur JImmunol.2018,48(2):344-354；

SIRPα存在于髓细胞中。配体CD47被许多细胞表达，并且通常据称作为“不要吃我(don’t eat me)”信号。它经常在癌细胞上过表达。在一些临床前模型中，CD47-SIRPα阻断当与靶向不同肿瘤抗原的IgG mAb(诸如西妥昔单抗、曲妥珠单抗和利妥昔单抗)组合时，增强癌症免疫疗法。在WO2015/138600中描述了具有利妥昔单抗的可变区的IgA抗体与抗SIRPα抗体(KWAR23)的组合。

在本发明中，示出了CD47-SIRPα检查点抑制强烈地增强体内IgA抗体的效果。我们示出了，在体外实验以及体内异种和同系小鼠模型中阻断CD47-SIRPα相互作用导致基于IgA的抗癌疗法的增强。在同系小鼠模型中，我们证明了当IgA疗法与SIRPα阻断组合时，中性粒细胞流入的显著增加，并且这些中性粒细胞对于清除肿瘤细胞是必需的，因为这些中性粒细胞的耗尽会破坏治疗。这是IgA的独特特征，因为在存在CD47-SIRPα检查点阻断的情况下，IgG治疗分子既不显示出中性粒细胞的这种强募集，也不显示出肿瘤杀伤的强增强。

发明概述

本发明提供了一种刺激中性粒细胞介导的对表达CD47的细胞的杀伤的方法，该方法包括在存在第一结合部分和第二结合部分的情况下，使中性粒细胞与表达CD47和另一种细胞外膜结合抗原的细胞接触，其中所述第一结合部分特异性地结合髓样IgA受体(CD89)和所述抗原，并且其中所述第二结合部分特异性地结合CD47和/或SIRPα并阻断所述中性粒细胞中CD47介导的SIRPα信号传导。

本发明还提供了第一结合部分和第二结合部分，其中所述第一结合部分特异性地结合CD89和另一种细胞外膜结合抗原，并且其中所述第二结合部分特异性地结合CD47和/或SIRPα并阻断CD47介导的SIRPα信号传导。

本发明还提供了一种增加在个体的癌症中的中性粒细胞流入的方法，该方法包括向有相应需要的个体施用第一结合部分和第二结合部分，其中所述第一结合部分特异性地结合所述癌症的细胞上的CD89和细胞外膜结合抗原，并且其中所述第二结合部分特异性地结合CD47和/或SIRPα并阻断CD47介导的SIRPα信号传导。

本发明还提供了用于治疗患有癌症的个体的第一结合部分和第二结合部分，其中所述第一结合部分特异性地结合CD89和细胞外膜结合抗原，并且其中所述第二结合部分特异性地结合CD47和/或SIRPα并阻断CD47介导的SIRPα信号传导。

所述肿瘤优选地具有肿瘤细胞、肿瘤基质细胞和/或T调节细胞。第一结合部分优选地是结合所述肿瘤的肿瘤细胞上的细胞外膜结合抗原的IgA抗体。细胞外膜结合抗原优选地是另外的细胞外膜结合抗原，所述另外的细胞外膜结合抗原不是IgA受体。另外的细胞外膜结合抗原优选地与抗体的可变结构域结合。肿瘤优选地对中性粒细胞介导的ADCC或胞啃(trogocytosis)敏感。细胞上的细胞外膜结合抗原优选地选自由以下组成的组：CD19、CD21、CD22、CD24、CD27、CD30、CD33、CD38、CD44、CD52、CD56、CD64、CD70、CD96、CD97、CD99、CD115、CD117、CD123、间皮素、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、PD-L1(CD274)、Her2/neu(CD340)、Her3、EGFR、PDGFR、SLAMF7、VEGFR1、VEGFR2、DR5、TF、GD2、GD3、PTHR2、CTLA4或CD2。

本发明还提供了编码第一结合部分和第二结合部分的核酸分子。

本发明还提供了包含核酸的细胞，所述核酸编码并表达第一结合部分、第二结合部分或两者。

第一结合部分优选地结合CD89和另一种细胞外膜结合抗原。第一结合部分优选地是结合髓样IgA受体(CD89)的抗体。第一结合部分，第一抗体，优选地包含结合CD89的恒定区。恒定区优选地是IgA恒定区。第一抗体优选地包含IgA CH1、CH2、CH3和铰链区。另外的细胞外膜结合抗原优选地被第一抗体的一个或更多个可变区结合。

第二结合部分优选地特异性结合CD47和/或SIRPα并阻断所述中性粒细胞中CD47介导的SIRPα信号传导。

本发明还提供了一种治疗患有肿瘤的个体的方法，该方法包括向有相应需要的个体施用第一结合部分和第二结合部分，其中所述第一结合部分特异性地结合所述肿瘤的细胞上的CD89和细胞外膜结合抗原，并且其中所述第二结合部分特异性地结合CD47和/或SIRPα并阻断CD47介导的SIRPα信号传导。

还提供了一种使中性粒细胞靶向个体中的细胞的方法，该方法包括向有相应需要的个体施用第一结合部分和第二结合部分，其中所述第一结合部分特异性地结合细胞上的CD89和另一种细胞外膜结合抗原，并且其中所述第二结合部分特异性地结合CD47和/或SIRPα并阻断CD47介导的SIRPα信号传导。

发明详述

中性粒细胞的名称来源于苏木精和伊红(H&E)组织学或细胞学制剂的染色特征。嗜碱性白细胞染成深蓝色并且嗜酸性白细胞染成亮红色，而中性粒细胞染成中性粉色。通常，中性粒细胞包含分成2-5个叶(lobe)的细胞核。中性粒细胞是吞噬细胞类型，并且通常存在于血流中。在特别是由于细菌感染、环境暴露和一些癌症的炎症的开始(急性)期期间，中性粒细胞是向炎症部位迁移的炎症细胞的第一响应者之一。它们在被称为趋化性的过程中遵循诸如白细胞介素-8(IL-8)、C5a、fMLP、白三烯B4和H2O2等的化学信号而迁移通过血管，然后通过间质组织。

提供了一种刺激中性粒细胞介导的对表达CD47的细胞的杀伤的方法，该方法包括在存在第一结合部分和第二结合部分的情况下，使中性粒细胞与表达CD47和另一种细胞外膜结合抗原的细胞接触，其中所述第一结合部分特异性地结合髓样IgA受体(CD89)和所述抗原，并且其中所述第二结合部分特异性地结合CD47和/或SIRPα并阻断所述中性粒细胞中CD47介导的SIRPα信号传导。

中性粒细胞与在细胞上表达CD47和另一种细胞外膜结合抗原的细胞接触。另外的细胞外膜结合抗原可以用于选择将被中性粒细胞杀死的特定细胞类型，用于选择细胞上用于引导中性粒细胞的靶或用于另外的原因。进行靶选择的一些原因是一些靶更丰富、更适于靶向、更易接近和/或具有可通过与结合部分或结合部分的组合结合而被增强或被抑制的功能。

另外的细胞外膜结合抗原优选地是肿瘤细胞上存在的抗原。此类抗原还被称为肿瘤抗原。在肿瘤抗原在成人中仅在肿瘤细胞上显著表达的意义上，该抗原可以是肿瘤选择性的。通常肿瘤抗原不是肿瘤选择性的，而是由于其他原因被选择。例如但不限于由于在细胞的有功能障碍的途径中而被选择。在非限制性情况下，肿瘤抗原是被细胞过表达的抗原。肿瘤抗原优选地是选自以下的抗原：CD19、CD21、CD22、CD24、CD27、CD30、CD33、CD38、CD44、CD52、CD56、CD64、CD70、CD96、CD97、CD99、CD115、CD117、CD123、间皮素、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、PD-L1(CD274)、Her2/neu(CD340)、Her3、EGFR、PDGFR、SLAMF7、VEGFR1、VEGFR2、DR5、TF、GD2、GD3或PTHR2。

在一种实施方案中，肿瘤抗原是CD20。

在一些实施方案中，本发明的手段、方法和用途不包括特异性结合CD20的第一结合部分。

在一些实施方案中，本发明的手段、方法和用途不包括特异性结合CD89和CD20的第一结合部分。

在一些实施方案中，本发明的手段、方法和用途不包括特异性结合CD89和CD20的第一结合部分以及特异性结合SIRPα的第二结合部分。

在一些实施方案中，本发明的手段、方法和用途不包括特异性结合CD89和CD20的第一结合部分以及特异性结合SIRPα的第二结合部分，其中所述第一结合部分包括利妥昔单抗的CDR1、CDR2和CDR3区。

在一些实施方案中，本发明的手段、方法和用途不包括特异性结合CD89和CD20的第一抗体以及特异性结合SIRPα的第二抗体。

在一些实施方案中，本发明的手段、方法和用途不包括特异性结合CD20的第一IgA抗体以及特异性结合SIRPα的第二抗体，其中所述第一抗体优选地包含利妥昔单抗的CDR1、CDR2和CDR3区。

另外的细胞外膜结合抗原优选地是在T调节细胞(Treg)上存在的抗原。调节性T细胞，也被称为抑制性T细胞，是调节免疫系统、保持对自身抗原的耐受性并预防自身免疫性疾病的T细胞亚群。Treg是免疫抑制性的，并且通常抑制或下调效应T细胞的诱导和增殖。此类细胞通常在肿瘤中发现，在肿瘤中它们被认为抑制或降低宿主对肿瘤细胞的免疫应答。在本发明中，另外的细胞外膜结合抗原优选地是Treg上的抗原(也被称为Treg抗原)，优选地但不限于CTLA4或CD25。杀死肿瘤中的Treg增强肿瘤中的免疫应答。

另外的细胞外膜结合抗原优选地是在肿瘤基质细胞上表达的抗原。基质细胞是任何器官例如在子宫粘膜(子宫内膜)、前列腺、骨髓、淋巴结和卵巢中的结缔组织细胞。它们是支持该器官的实质细胞的功能的细胞。最常见的基质细胞包括成纤维细胞和周细胞。已知基质细胞和肿瘤细胞之间的相互作用在癌症生长和进展中发挥主要作用。据信，如果基质细胞不生长，许多肿瘤就不能生长。某些类型的皮肤癌(基底细胞癌)不能扩散到全身，因为癌细胞需要附近的基质细胞来继续分裂。当癌在整个身体内移动时，失去这些基质生长因子阻止癌侵袭其他器官。中性粒细胞诱导的对基质细胞的细胞杀伤可以减少肿瘤生长。

第一结合部分结合CD89和所述另外的细胞外膜结合抗原，从而将表达CD89的细胞和表达另外的细胞外膜结合抗原的细胞连接在一起。结合部分与CD89的结合可以活化中性粒细胞的细胞杀伤活性。细胞杀伤活性可以包括ADCC活性、ADCP活性或其组合，或中性粒细胞的其他细胞杀伤活性。

第二结合部分结合由细胞表达的CD47。CD47通常也由表达另外的细胞外膜结合抗原的细胞表达。由细胞表达的CD47被认为能够与中性粒细胞上的SIRPα相互作用，并且降低原本由表达SIRPα的细胞表达的免疫应答。SIRPα是在中性粒细胞上表达的那些之一。

当本文提及结合部分诸如但不限于与抗原结合的抗体时，意图指定结合剂的结合能力。在这样的情况下，通常不意味着结合剂实际上被抗原结合。它也指不与抗原缔合或结合时的结合部分。结合部分诸如抗体通过结合抗原上的表位来结合抗原。如果结合部分诸如抗体结合抗原上的表位，而不结合其他表位，或者至少较少地结合其他表位，则结合部分被认为结合抗原。例如，CD47特异性抗体以至少10e-6，优选地10-e7或更小的KD结合CD47。它与成人细胞上存在的另一种细胞外抗原的结合至少少100倍。

第二结合部分特异性地结合CD47和/或SIRPα，并阻断中性粒细胞中CD47介导的SIRPα信号传导。CD47/SIRPα信号传导轴及其在临床环境中的效用最近在Matlung等人,Immunol Rev.2017；276(1):145-64中进行了综述。Matlung等人描述了结合CD47或SIRPα并阻断分子的信号传导的多种抗体。当然，在其他方面相同的条件下但不存在阻断分子的情况下比较阻断能力。优选的被阻断的SIRPα信号传导是诱导免疫应答抑制效应的信号传导。优选的CD47结合抗体是在EP2992089中描述的抗体C47A8-CQ；在US20140303354中描述的5A3-M5；和在US2018201677中描述的2.3D11，这些专利通过引用并入本文，用于说明阻断CD47-SIRPα信号传导的优选的CD47结合抗体。在WO2017178653中描述了优选的SIRPα结合抗体，该专利通过引用并入本文，用于说明优选的SIRPα结合抗体。其中优选的抗体阻断CD47-SIRPα信号传导。

中性粒细胞介导的对表达CD47的细胞的杀伤的刺激可以通过在存在和不存在本发明的结合部分的情况下测量杀伤来测量。在存在时的另外的细胞杀伤被认为是中性粒细胞介导的细胞杀伤。该效应通常在体外系统中测量，但也可以至少半定量地在体内测量。

如本文定义的结合部分是蛋白质结合部分。结合部分通常是肽、最多且包括20个氨基酸的环状肽或双环肽或具有多于20个氨基酸残基的多肽。本领域知晓许多蛋白质结合分子。这些蛋白质结合分子通常包括一个或更多个完整的或衍生的抗体可变结构域。非限制性实例是单链Fv片段、单抗体(monobody)、VHH、Fab片段。衍生的可变结构域可以是人工的或自然进化的衍生物，均属于具有免疫球蛋白折叠的蛋白质类。包含非免疫球蛋白折叠的蛋白质结合部分的实例是最初由Amgen开发的亲和多聚体(avimer)。

如本文描述的结合部分优选地是抗体。抗体，也被称为免疫球蛋白(Ig)，是大的、典型的Y形蛋白。抗体与免疫系统的多种组分相互作用。一些相互作用由其Fc区(位于“Y”的底部)介导，Fc区包含参与这些相互作用的位点。

抗体是属于免疫球蛋白超家族的蛋白。它们通常具有两个重链和两个轻链。存在几种不同类型的根据可附接至抗原结合片段的五种不同类型的可结晶片段(Fc)定义的抗体重链。五种不同类型的Fc区允许将抗体分组成五种同种型。特定抗体同种型的Fc区能够与其特异性Fc受体(FcR)结合，从而允许抗原-抗体复合物根据其结合的FcR来介导不同的作用。IgG抗体与其相应的FcR结合的能力由相互作用位点的存在/不存在以及在其Fc区内位点处存在的聚糖(如果有的话)结构调节。抗体结合FcR的能力有助于为它们遇到的每一种不同类型的外来对象引导适当的免疫应答。

虽然所有抗体的一般结构是相似的，但抗体蛋白尖端处的区高度可变(extremelyvariable)，允许数百万个具有略微不同的尖端结构或抗原结合位点的抗体存在。该区被称为高变区。抗体结合抗原的巨大多样性在很大程度上由高变区和包含高变区的可变结构域限定。

本发明的抗体通常是全长抗体。术语“全长抗体”被定义为包含基本上完整的(complete)免疫球蛋白分子，然而全长抗体不一定具有完整(intact)免疫球蛋白的所有功能。为了避免疑问，全长抗体具有两个重链和两个轻链。每个链包含恒定(C)区和可变(V)区。全长抗体的重链通常包含CH1、CH2、CH3、VH区和铰链区。全长抗体的轻链通常包含CL区和VL区。

抗体经由Fab部分中包含的可变区结构域与抗原结合。抗体可变结构域包含重链可变区和轻链可变区。根据本发明的全长抗体包含重链和轻链，其中可以存在提供所需特征的突变。全长抗体不应该具有任何区的重要部分(substantial part)的缺失。然而，其中一个或几个氨基酸残基被取代、插入、缺失或其组合而基本上不改变所得抗体的抗原结合特性的IgG或IgA分子包含在术语“全长”抗体中。例如，“全长”抗体可以具有1个和10个(包含端点)之间的氨基酸残基(优选地在非CDR区中)的取代、插入、缺失或其组合，其中缺失的氨基酸对于抗体的抗原结合特异性不是必需的。

第一结合部分优选地是IgA抗体。抗体优选地经由抗体的恒定区特异性地结合髓样IgA受体(CD89)，并且经由一个或更多个可变结构域特异性地结合所述抗原。

IgA具有两个亚类(IgA1和IgA2)，并且可以以单体和二聚体形式产生。本发明中的抗体优选地是单体抗体。本发明的抗体中的IgA元件优选地是人IgA元件。IgA元件可以是IgA1元件或IgA2元件。本发明的抗体中的IgA元件可以全部为IgA1元件或全部为IgA2元件或为IgA1元件和IgA2元件的组合。IgA元件优选地是人IgA元件。优选地，抗体中的全部IgA元件都是人IgA元件。IgA元件可以是IgA1元件，优选地人IgA1元件。IgA元件也可以是IgA2，优选地IgA2m(1)元件，优选地人IgA2m(1)元件。优选的是CH1结构域、CH3结构域或其组合是IgA CH1结构域、IgA CH3结构域或其组合。优选的是IgA CH1结构域和/或铰链区是人IgACH1结构域和/或人IgA铰链区。所述人IgA CH1结构域和/或人IgA铰链区优选地是人IgA1CH1结构域或人IgA1铰链区。所述人IgA CH1结构域和/或人IgA铰链区优选地是人IgA2m(1)CH1结构域或人IgA2m(1)铰链区。抗体的恒定结构域和铰链区优选地是人恒定区和铰链区，优选地人IgA抗体的恒定区和铰链区。抗体的恒定结构域和铰链区优选地是人IgA1或人IgA2m(1)恒定结构域和铰链区。

相对于自然界中发现的人类等位基因，人恒定区可以具有0-15个氨基酸变化。氨基酸变化可由于多种原因引入。非限制性实例包括但不限于提高抗体的产量或同质性、适应循环中的半衰期、HC/LC组合的稳定性、优化糖基化、调节二聚化或复合物形成、调节ADCC活性。相对于自然界中发现的人类等位基因，人恒定区可以具有0个；1个；2个；3个；4个；5个；6个；7个；8个；9个；10个；11个；12个；13个；14个和15个氨基酸变化。改变的氨基酸优选地是从不同同种型的相应位置的氨基酸中选择的氨基酸。

在一种实施方案中，重链的恒定区是IgA2恒定区，优选地人IgA2恒定区，优选地人IgA2m(1)。在一个方面中，人恒定区是突变的IgA2m(1)序列。

在一种实施方案中，抗体包含IgA2m(1)序列的恒定区，优选地具有以下突变中的至少一个，和优选地至少2个；3个；4个；5个，以及优选至少7个：N166G；P221R；N337T；I338L；T339S；C331S；以及人IgA2m(1)抗体的C末端氨基酸序列的突变为“…VDGTCY”变成“…VDGT”。图3示出了人IgA1的序列；IgA2m(1)的序列和优选的突变IgA2m(1)序列(hIgA2.0)。

在可选择的实施方案中，抗体包含hIgA2.0区的恒定区，其中3-20个C-末端氨基酸缺失，从而产生IgA3.0恒定区。图3E示出了优选的hIgA2.0恒定区的序列，其中可以被缺失以产生IgA3.0恒定区的C末端氨基酸被加下划线。

尽管已知IgA为粘膜抗体，但在单体形式，它是人血清中存在的第二类抗体。在先前的研究中，我们已经示出抗肿瘤抗体IgA在体外可以是有效的。抗肿瘤机制是不同的并且主要通过中性粒细胞的募集，中性粒细胞是最丰富的白细胞类型。体内IgA作为治疗性抗体也可以是有效的。IgA分子可以但不一定具有相对短的平均半衰期。本领域知晓增加体内IgA抗体的半衰期的多种方法。一种是实现不同的糖基化。另一种是包括促进与新生儿Fc受体FcRn结合的结合部分(binding aspect)。在一个方面中，本发明提供了特异性IgA抗体，通过向它们提供适配的糖基化和/或用例如白蛋白结合结构域(ABD)使IgA间接靶向FcRn(Meyer等人,2016Mabs第8卷:第87-98页)，或通过FcRn靶向部分，诸如白蛋白的DIII结构域使IgA直接靶向FcRn。因此，IgA可以是具有一个或更多个突变的改编的IgA抗体(adaptedIgA antibody)和/或两个或更多个IgA分子的恒定区的嵌合体。

第二结合部分优选地是抗体。该抗体的恒定区优选地被修饰，使得其不介导效应物功能。抗体优选地是IgG4或具有效应物功能缺陷的修饰的IgG1、IgG2和IgG3。

肿瘤细胞和肿瘤优选地是赘生性细胞或赘生物。赘生物是组织的异常生长，并且当它也形成团块时，通常被称为肿瘤。本发明中的赘生物通常形成团块。赘生性细胞是来自已经形成团块的赘生物的细胞。世界卫生组织(WHO)将赘生物分为四大类；良性赘生物、原位赘生物、恶性赘生物和不确定或未知行为的赘生物。恶性赘生物也被简称为癌症。癌症优选地是腺癌。优选的癌症是结肠直肠癌；胰腺癌；肺癌；乳腺癌；肝癌；前列腺癌；卵巢癌；宫颈癌；子宫内膜癌；头颈癌；黑色素瘤；睾丸癌；尿路上皮癌；肾癌；胃癌；或类癌(carcinoidcancer)。在优选的实施方案中，癌症是结肠直肠癌；胰腺癌；肺癌；乳腺癌；肝癌；前列腺癌；卵巢癌；宫颈癌；子宫内膜癌；头颈癌；或黑色素瘤。在特别优选的实施方案中，癌症是结肠直肠癌；胰腺癌；肺癌；乳腺癌；或肝癌。在特别优选的实施方案中，癌症是胃肠癌。

在一种实施方案中，肿瘤或肿瘤细胞对中性粒细胞介导的ADCC或胞啃敏感。在本发明的一个方面中，在根据本发明的方法或目的限制的产品权利要求进行治疗之前，测试肿瘤细胞对中性粒细胞介导的ADCC或胞啃的敏感性。

细胞上的细胞外膜结合抗原优选地是肿瘤抗原。它优选地选自由以下组成的组：CD19、CD20、CD21、CD22、CD24、CD27、CD30、CD33、CD38、CD44、CD52、CD56、CD64、CD70、CD96、CD97、CD99、CD115、CD117、CD123、间皮素、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、PD-L1(CD274)、Her2/neu(CD340)、Her3、EGFR、PDGFR、SLAMF7、VEGFR1、VEGFR2、DR5、TF、GD2、GD3或PTHR2。细胞上的细胞外膜结合抗原优选地选自由以下组成的组：CD19、CD21、CD22、CD24、CD27、CD30、CD33、CD38、CD44、CD52、CD56、CD64、CD70、CD96、CD97、CD99、CD115、CD117、CD123、间皮素、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、PD-L1(CD274)、Her2/neu(CD340)、Her3、EGFR、PDGFR、SLAMF7、VEGFR1、VEGFR2、DR5、TF、GD2、GD3或PTHR2。在一种实施方案中，在根据本发明的方法或目的限制的产品权利要求进行治疗之前，首先测试肿瘤或肿瘤细胞的所指定的抗原的存在。

附图简述

图1：SIRPα的抑制增强异种长期体内模型中的肿瘤根除。

(A)体内异种模型和注射方案(B-C)长期体内小鼠模型的示意性概况，使用相当于母体细胞系的人A431-SCR细胞(B)和无CD47表达的细胞系(A431-CD47KO)(C)。当小鼠在第6天具有可见肿瘤时，用PBS(黑线)、单次iv注射50μg西妥昔单抗(红线)或iv注射250μg抗EGFR-IgA2，然后4次i.p.注射(由于与西妥昔单抗相比的IgA的较短半衰期)(蓝线)开始治疗。用卡尺测量肿瘤长大(outgrowth)，并且体积被计算为长×宽×高。示出的数据是1个实验的平均值±SEM，每组8只小鼠，(B)n＝8，(C)n＝8。对第17天进行统计，使用双因素ANOVA以及用于多重检验的Tukey校正。ns＝不显著，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图2：当抑制SIRPα时，用人HER2(Ba/F3-HER2)或EGFR(Ba/F3-EGFR)转染的Ba/F3细胞在体外和体内被小鼠中性粒细胞有效杀死。

(A)HER2和CD47在Ba/F3-HER2细胞中的表达以及EGFR和CD47在Ba/F3-EGFR细胞中的表达。(B)由从野生型(NTg)或FcαR-转基因(FcαR-Tg)小鼠分离的小鼠中性粒细胞不与SIRPα的抑制组合(白色背景)或与SIRPα的抑制(灰色背景)组合引起的对曲妥珠单抗或抗HER2-IgA2调理的Ba/F3-HER2细胞的ADCC。(C)与(B)相同，但是是对西妥昔单抗或抗EGFR-IgA2调理的Ba/F3-EGFR细胞的ADCC。(D)在体内小鼠实验中，SIRPα的抑制与曲妥珠单抗或抗HER2-IgA2组合，示出在野生型小鼠(PBS、同种型+Tmab、抗SIRPα+Tmab)或FcαR-转基因小鼠(同种型+抗HER2-IgA2、抗SIRPα+抗HER2-IgA2)中Ba/F3-HER2细胞和Ba/F3细胞的比。(E)在(D)中的实验结束时腹膜腔中存在的粒细胞(Ly6G

图3：IgA1/IgA2.0杂合抗体的一级序列和建模。

A，hIgA1、IgA2m(1)和IgA1/IgA2m(1)杂合体(hIgA2.0)的恒定区的一级序列的比对。残基根据骨髓瘤IgA1蛋白(Bur)方案进行编号。结构域边界由序列上方的垂直线指示。突出显示了以下特征：加浅灰色下划线的残基是IgA1独有的，加深灰色下划线的天冬酰胺是保守的N-糖基化共有序列，并且加黑色下划线的残基是IgA2.0独有的。B，225-IgA2.0的重链被建模并以前视图和侧视图图示，突变被标出。C，野生型和突变体IgA2的重链被建模。所得的比对表明C241在IgA2-wt的重链中的取向与IgA2.0不同，可能是由于P221R突变。D、关注225-IgA2-wt(绿色，C471；红色，Y472)和IgA2.0(红色)的尾片段。模型的预测和比对使用I-TASSER进行；在3D-Mol Viewer中调整(modify)模型。E，示出IgA2重链的氨基酸序列(UniProt参考号:P01877)的图示。突出显示的氨基酸描绘了在IgA2.0恒定区经受取代的氨基酸。所有或部分加下划线的C-末端氨基酸可以被缺失，以产生IgA3.0恒定区。

图4：3种CD47抗体序列的多重序列比对。

三种抗体对其靶CD47的亲和力低(L)、中(M)或高(H)并且在其序列上显著不同，特别是在其互补决定区(CDR)上显著不同。序列衍生自CD47抗体C47A8-CQ(低亲和力)、5A3-M5(中等亲和力)和2.3D11(高亲和力)，记载于WO2014087248A2(5A3-M5)、EP2992089A1，Barbara Swanson等人Sorrento therapeutic(C47A8-CQ)和creative biolabs，目录号：HPAB-0097-CN(2.3D11)。为了比对目的，VH和VL序列被串联粘贴，但是在抗体中没有以这种方式连接。

图5：转染优化和纯化。

为了产生抗体，在HEK293F细胞中设计转染条件(a)。在选择生产条件后，抗体首先通过κ轻链亲和纯化(b)纯化，然后通过尺寸排阻色谱法(c)纯化。示出来自纯化程序的一张代表性的图片。

图6：CD47抗体的结合特异性。

通过流式细胞术在A431(a)和CD47敲除A431(b)细胞系中测试结合。三种抗体(L、M、W)示出特异性结合，具有不同的亲和力(c)。

图7：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。

ADCC测定确定四种不同CD47抗体(如上文描述的)和B6H12(一种小鼠IgG1 mAb，作为NK细胞介导的杀伤的阳性对照)的杀伤活性。对于使用PBMC(a)或PMN(b)的ADCC测定，效应细胞:靶细胞的比分别为100:1和40:1。在4小时后测量细胞毒性。n＝3次重复±SEM。

图8：在抗CD47和抗CD20组合治疗的情况下中性粒细胞介导的ADCC诱导的Daudi细胞的细胞裂解。

ADCC测定确定抗CD47抗体(克隆2.3D11)和IgG或IgA3.0同种型的抗CD20抗体(奥妥珠单抗的可变区)，以及抗CD47抗体和抗CD20抗体的组合的杀伤活性。将Daudi细胞与效应细胞和10μg/ml、1μg/ml或0.1μg/ml(高-中-低浓度)的抗CD20抗体和/或20μg/mL、2μg/mL、0.2μg/mL的抗CD47抗体(高-中-低)一起孵育。Obi是具有奥妥珠单抗的可变结构域的抗CD20抗体。

图9：在抗CD47和抗CD20组合治疗的情况下中性粒细胞介导的ADCC诱导的Ramos细胞的细胞裂解。

(a)图6和图7的三种CD47抗体以0μg/ml、0.2μg/ml、2μg/ml和20μg/ml的浓度被测试。CD20抗体以0μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml的浓度被测试。(b)是类似于(a)的实验。在(a)中，CD20抗体具有IgA2.0恒定部分，而在(b)中，使用IgA3.0抗CD20抗体。在实验(a)和(b)两者中，在抗CD47和抗CD20组合治疗的情况下，杀伤增强。在4小时后测量细胞裂解。n＝3次重复；±SEM。Obi是具有奥妥珠单抗的可变结构域的抗CD20抗体。

图10：在抗CD47和抗GD2组合治疗的情况下中性粒细胞介导的ADCC诱导的Ramos细胞的细胞裂解。

神经母细胞瘤癌细胞系SH-Sy5y(图10A和图10D)、SKNFI(图10C和图10E)和LAN5(图10B)与具有IgA或IgG同种型的抗GD2抗体并且在存在或不存在抗CD47抗体的情况下一起孵育。全白细胞(图10A-图10C)或外周单个核细胞(peripheral mononuclear cell，PMN)(图10D和图10E)用作效应细胞。在癌细胞与单一抗体一起孵育的条件下，使用10μg/ml、1μg/ml或0.1μg/ml抗体。在抗GD2抗体和抗CD47抗体的组合治疗下，10μg/ml、1μg/ml或0.1μg/ml的IgA抗GD2抗体与20μg/ml、2μg/ml或0.2μg/ml的抗CD47抗体组合。应用于确定ADCC的方法与图7、图8和图9相同。在4小时后测量细胞裂解。n＝3次重复；±SEM。

实施例

实施例1

结果

在体内异种和同系小鼠模型中，当抑制CD47-SIRPα相互作用时，IgA诱导对A431和Ba/F3癌细胞的细胞毒性。

在体内环境中评估阻断CD47-SIRPα相互作用与IgA治疗性抗体组合的效果。使用在SCID背景上表达人FcαRI的小鼠(Boross等人,2013EMBO Mol Med 5:1213-26)。研究了具有人表皮样细胞系A431的长期异种体内小鼠模型。在这个特定的模型中，我们比较了在同一只小鼠中，表达CD47的A431细胞系与通过CRISPR/Cas9干扰去除CD47表达的细胞系(A431-CD47KO)的肿瘤生长。如所指示的，用PBS、西妥昔单抗或抗EGFR-IgA2处理各组小鼠(图1A)。在17天后，与西妥昔单抗相比，在抗EGFR-IgA2治疗后，仅CD47KO A431肿瘤的肿瘤体积显著减少(图1B、图1C)。

为了检查中性粒细胞在体内作为效应细胞的作用，我们使用在表达人FcαRI的小鼠中的同系小鼠模型(Boross等人,2013EMBO Mol Med 5:1213-26)与抗小鼠SIRPα特异性抗体MY-1的组合，以阻断CD47和SIRPα之间的相互作用(Yanagita等人；2017JCI insight 2(1):e89140)。为了确定小鼠中性粒细胞在该系统中执行ADCC的能力，我们首先从FcαRI转基因小鼠和野生型小鼠的骨髓中分离出小鼠中性粒细胞。表达人HER2/neu或EGFR的不表达小鼠SIRPα的小鼠前B细胞系Ba/F3被用作靶，与伴有MY-1的IgA2/IgG抗HER2/neu或抗EGFR组合(图2A)。在存在完整的CD47-SIRPα信号传导轴的情况下，没有观察到抗体依赖性的中性粒细胞介导的对两种靶系的杀伤。然而，尤其是抗HER2/neu治疗性抗体的IgA2变体通过表达FcαR的中性粒细胞显著增强ADCC，这可以通过对表达HER2/neu和EGFR的Ba/F3细胞的SIRPα检查点阻断来进一步增加(图2B、图2C)。这些结果示出，在这种设置中，使用IgA治疗性抗体导致与IgG相比显著更高的ADCC，特别是在通过阻断抗体MY-1阻断SIRPα/CD47信号传导后，阻断抗体MY-1增强小鼠中性粒细胞对表达HER2/neu和EGFR的肿瘤细胞的杀伤。

接下来，我们评估了如先前描述的在同系小鼠模型中SIRPα阻断对IgA治疗的影响(Boross等人,2013EMBO Mol Med 5:1213-26)。我们比较了在存在或不存在CD47/SIRPα阻断的情况下，抗HER2 IgG或IgA亚类的治疗性抗体。将荧光Ba/F3和Ba/F3-HER2细胞注射在腹腔中，并且在存在或不存在CD47/SIRPα抑制的情况下与治疗性抗体组合。使用流式细胞术证实巨噬细胞和中性粒细胞上的SIRPα受体与MY-1的饱和(数据未示出)。与体外设置相比，通过MY-1在体内阻断CD47/SIRPα，与单独使用IgG或IgA治疗性抗体相比，导致肿瘤负荷显著且实质增加的减少(significant and substantial increased reduction)(图2D)。有趣的是，在MY-1与治疗性抗体组合的情况下，抗体介导的肿瘤负荷的减少伴随着粒细胞的大量流入。与使用曲妥珠单抗相比，当使用抗HER2-IgA2时，这种中性粒细胞流入最明显(图2E、图2F)。在该情况下，除了巨噬细胞的少量减少之外，没有检测到其他白细胞群体流入的变化(图2F)。数据示出阻断CD47-SIRPα信号传导增加了同系体内小鼠模型中抗HER2-IgA2的治疗效力。

该中性粒细胞是在体内小鼠模型中负责杀死Ba/F3-HER2细胞的效应细胞群体，这是通过使用抗Ly6G抗体耗尽中性粒细胞所示出的。这种耗尽没有导致其他白细胞群体的显著变化(数据未示出)。当小鼠的中性粒细胞耗尽时，使用抗EGFR-IgA2和MY-1时仅出现有限的ADCC(图2G)，指示中性粒细胞确实参与该小鼠肿瘤模型的细胞毒性效应。结果示出，中性粒细胞是重要的效应细胞，可以通过抗肿瘤抗原抗体成功地招募用于治疗性清除，并且通过抑制CD47-SIRPα信号传导来增加治疗效果。

结果示出，在体外和体内，IgA介导的抗肿瘤治疗可以受到CD47-SIRPα相互作用的限制。这是从本文描述的短期同系和长期异种小鼠模型两者中推断出来的。重要的是，这种限制可以通过CD47或SIRPα阻断抗体在治疗上克服。

材料和方法

细胞和培养

来自ATCC的细胞系(A431和Ba/F3)根据供应商的建议进行培养。

A431-CD47KO细胞系通过pLentiCrispR-v2–CD47KO(pLentiCrispR-v2由FengZhang惠赠(Addgene质粒#52961))的慢病毒转导产生，使用5’cagcaacagcgccgctacca 3’作为CD47 CrispR靶序列。用1μg/mL的嘌呤霉素随后进行有限稀释选择转导的细胞。通过FACS染色选择缺乏CD47表达的克隆。表达HER2/neu的A431细胞(A431Her2Neu)是通过逆转录病毒转导，随后通过基于嘌呤霉素抗性的阳性选择产生的，如先前描述的(Brandsma等人2015:Cancer Immunol Res 3(12):1316-24)。

将表达EGFR的Ba/F3细胞用WT EGFR(upstate)转染，并且表达EGFR的克隆使用新霉素选择。表达HER2/neu的Ba/F3细胞是通过逆转录病毒转导，随后使用嘌呤霉素抗性进行阳性选择和有限稀释产生的。

中性粒细胞分离

如下地将小鼠中性粒细胞从小鼠骨髓中分离：将大鼠抗小鼠CD16/CD32(BDPharmingen，克隆2.4G2)在1mL MACS缓冲液(含有磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH 7.2，0.5％牛血清白蛋白(BSA)和2mM EDTA)中以25μg/mL的浓度在冰上孵育20分钟。在孵育后，以1μg/mL的浓度直接添加抗Ly6G-APC(克隆1A8，BD Biosciences)在冰上持续30-45分钟。最后，每10

抗体和试剂

IgG曲妥珠单抗(Roche)、IgG西妥昔单抗(Merck KGaA)、抗HER2-IgA、抗CD20-IgA2和抗EGFR-IgA2如所描述的产生(Dechant 2007:J.Immunol.179(5):2936-43,Meyer2015MABs 8(1):87-98)，并且以0.5μg/mL的最终浓度使用，除非另有说明。

为了阻断小鼠SIRPα，我们在我们的体外研究中使用了最终浓度为10μg/mL的大鼠IgG2抗体MY-1，该抗体是由Takashi Matozaki(University of Kobe,Japan)团队慷慨赠与我们的(Yanagita等人；2017JCI insight2(1):e89140)。

小鼠

Ba/F3腹膜模型的实验用12周龄至38周龄的雄性和雌性人类FcαR转基因(Tg)小鼠进行，该小鼠在UMC Utrecht(Van Egmond等人1999:Blood93(12)4387-94)产生并且在Balb/cByJRj背景(Janvier,France)上回交，并保持半合子繁殖。转基因阴性(NTg)同窝小鼠用作对照小鼠。A431体内模型的实验用17周龄至70周龄的雌性人FcαR转基因(Tg)小鼠进行，该小鼠在UMC Utrecht(Van Egmond等人1999:Blood 93(12)4387-94)产生并且在SCID背景(CB17/lCR-Prkdc

先前描述了Ba/F3腹膜模型(Boross等人,2013EMBO Mol Med 5:1213-26)。简言之，将Ba/F3-HER2细胞和Ba/F3细胞分别用2μM或10μM的CT紫(CT violet)(Invitrogen,Thermofisher)在室温标记15min，并且然后以1:1的比混合。每只小鼠腹膜内注射在200μLPBS中的总共1×10

对于A431体内模型，在小鼠右侧注射5×10e5 A431-CD47KO细胞，将5×10

流式细胞术

腹膜中的效应细胞在4℃-7℃与5％正常小鼠血清(Equitech-bio)孵育45min后确定。随后，使用下列荧光标记的抗体，在4℃-7℃持续45-60min，以对不同的效应细胞类型进行染色：B220(RA3-6B2)C、I-A/I-E(M5/114.15.2)、CD8(53-6.7)、Ly-6G(1A8)、CD45(30-F11)、CD4(RM4-5)、F4/80(BM8)(Biolegend)和CD11b(m1/70)(BD biosciences)。

在从分析中排除Ba/F3细胞后，粒细胞被鉴定为Ly-6G+/CD11b+和F4/80-，巨噬细胞被鉴定为F4/80+/CD11b+，并且Ly-6G-淋巴细胞通过首先排除Ba/F3细胞、F4/80+/CD45+巨噬细胞和死细胞(7AAD+)接着通过CD45选择被分析，B细胞被鉴定为B220+/I-A/I-E+并且T细胞被鉴定为CD4+或CD8a+。通过比较注射的MY-1和抗大鼠Ig(BD biosciences)与离体添加的MY-1或同种型对照和抗大鼠Ig的染色，然后对巨噬细胞和粒细胞进行染色，来确定体内SIRPα的饱和。测量在FACSCantoII(BD biosciences)上进行，数据使用FACS Diva软件(BD biosciences)来分析。

对于CD47珠结合测定，使用浓度为20μg/mL的山羊抗人Alexa647IgG(H+L)(Invitrogen)。

使用曲妥珠单抗分析细胞系的HER2表达，使用西妥昔单抗分析细胞系的EGFR表达，使用B6H12(15)分析细胞系的人CD47表达，使用miap301(eBioscience)分析细胞系的鼠CD47表达，使用MY-1(26)分析细胞系的鼠SIRPα表达。

数据分析和统计

两组之间的统计差异使用(配对)t检验来检验；多重比较使用双因素ANOVA以及用于多重检验的Tukey校正来检验，或者使用单因素ANOVA测试然后Sidak或Dunett事后检验用于校正多重比较来检验，GraphPad Prism(GraphPad Software)。

讨论

我们在此首次示出，针对Her2/neu、EGFR和CD20的IgA抗体对中性粒细胞介导的癌细胞的细胞毒性在体外和体内都经受CD47-SIRPα的抑制。这项新发现示出CD47-SIRPα轴的抑制进一步增强以中性粒细胞作为效应细胞的IgA介导的抗肿瘤作用。许多CD47抗体和SIRPα-Fc蛋白目前正在与IgG治疗性抗体(www.clinicaltrials.gov标识符：NCT02216409；NCT02678338，NCT02641002；NCT02367196，NCT02890368；NCT02663518，NCT02953509)(20)组合在I/II期临床试验中测试。

在此，我们提供证据证明在我们的同系体内模型中，中性粒细胞是针对IgA抗体调理的癌细胞的重要效应细胞。这与我们早期的工作形成对比，在使用过表达EGFR的Ba/F3细胞的另一个短期体内模型中，巨噬细胞是消除IgA调理的肿瘤细胞的主要效应细胞(Boross等人,2013EMBO Mol Med 5:1213-26)。在该特定模型中，除了以不同的抗原表达水平使用靶向不同肿瘤抗原的不同治疗性抗体之外，CD47-SIRPα轴是完整的。这可能导致不同的效应细胞群体被活化并被招募以对抗抗体调理的癌细胞。本发明示出了中性粒细胞和巨噬细胞两者均可以通过IgA抗肿瘤抗体介导细胞毒性。

最近，发现CD47-SIRPα轴的检查点抑制通过活化CD8+T细胞和抑制CD4+T细胞来增加针对肿瘤的有效T细胞应答(Tseng等人,2013:Proc.Natl.Aced.Sci.U S A 110:11103-8)。虽然CD47-SIRPα检查点抑制刺激针对肿瘤的细胞毒性T细胞应答的确切机制是未知的，但可能涉及响应于增加的肿瘤物质摄取的增强的巨噬细胞介导的抗原呈递(Tseng等人,2013:Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 110:11103-8)，或甚至中性粒细胞抗原呈递的增加和贡献(Vono等人,2017:Blood 129(14):1991-2001)。将针对癌症的基于IgA的抗体治疗与CD47-SIRPα相互作用的抑制组合可以在肿瘤治疗的后期阶段中产生有效的适应性应答。

迄今为止，临床使用IgA抗癌抗体的重要缺点是IgA抗体在体内的半衰期短(Boross等人,2013EMBO Mol Med 5:1213-26)。目前，我们和其他人已经发现了延长IgA抗体的寿命的方法，例如通过糖工程化策略(Lohse等人,2016:Cancer Res.76(2):403-17；Rouwendal等人,2016:MAbs8(1):74-86)或通过在抗体工程化的帮助下增加与新生儿Fc受体FcRn的结合(Borrok等人,2015:MAbs 7(4):743-51；Meyer S等人,2016MAbs8(1):87-98；Li B等人,2017:Oncotarget.8(24):39356-66)，使它们在临床上的使用甚至更有效。

本发明还设想使用所谓的IgGA抗体，这样的抗体可以结合Fcγ受体，FcαR和FcRn两者。这样的IgGA抗体具有的半衰期与IgG抗体相当，并且能够在体外和体内都非常有效地接合NK细胞、巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞(Borrok等人,2015:MAbs 7(4):743-51；LiB等人,2017:Oncotarget.8(24):39356-66)。

实施例2

结果

与识别肿瘤抗原的IgA同种型抗体组合，抗CD47抗体示出对Daudi细胞和Ramos细胞两者的剂量依赖的增强的杀伤。

在体外环境中评估使用与IgA治疗性抗体组合的抗CD47抗体阻断CD47-SIRPα相互作用的效果。

为此，选择三种不同的抗CD47抗体(图4)进行表达和纯化。在不同的条件下用相应抗体的表达载体转染HEK293F细胞(图5A)，并且选择大规模生产的最佳条件。使用κ轻链亲和纯化(图5B)，随后进行尺寸排阻色谱法(图5C)从细胞培养上清液中纯化抗体。三种抗体示出对CD47不同的亲和力(低-中-高)(图6A和图6C)，但所有三种抗体都以高特异性结合CD47(图6B)。

接下来，使用PMN或PBMC作为效应细胞，和Daudi细胞作为靶细胞，测试三种抗体的ADCC活性。单独用抗CD47抗体孵育癌细胞导致细胞裂解(图7A和图7B)，这取决于抗体的浓度。当使用PMN作为效应细胞时，细胞裂解最明显(图7B)。在该情况下，具有高亲和力的抗CD47诱导最高百分比的细胞裂解。B6H12 mIgG1/k克隆不引发ADCC，因为它是不作用于中性粒细胞活化的mIgG1/k抗体。因此，在PBMC中仅观察到一个信号。

随后，我们比较了由具有IgG或IgA同种型的抗CD20抗体和具有高亲和力的抗CD47抗体诱导的ADCC。CD47/SIRPα检查点抑制以及具有IgA3.0恒定区的抗CD20抗体两者单独诱导的细胞裂解呈剂量依赖性(图8)。然而，在这两者组合时，裂解的细胞的百分比显著增加(图8)。

在两个实验中获得了相似的结果，其中Ramos细胞被用作靶细胞(图9A和图9B)。具有IgA2.0或IgA3.0恒定区的抗CD20抗体以及抗CD47抗体两者均诱导细胞裂解。值得注意的是，具有高亲和力的抗CD47抗体表现得更有效地诱导细胞裂解。当CD47/SIRPα阻断与具有IgA2.0或3.0恒定区的抗CD20抗体组合时，细胞裂解剂量依赖性地增加。同样与抗CD20抗体组合，诱导的细胞裂解百分比与抗CD47抗体的亲和力相关。

对于三种不同的神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y、SKNFI、LAN5)，我们观察到与抗GD2抗体(IgG和IgA两者)孵育的剂量依赖性效应(图10A-图10E)。抗CD47仅在SH-SY5Y和LAN5细胞中诱导ADCC。令人惊讶的是，当抗CD47抗体与具有IgA同种型的抗GD2抗体组合时，观察到加和效应。这显示与抗GD2抗体具有IgG同种型的相同组合的情况不同。这些效应不依赖于所使用的靶细胞，因为在使用PMN或全白细胞的实验之间的结果是相当的。

材料和方法

细胞和培养

从ATCC获得细胞系(A431、Daudi、Ramos)，并在含有RPMI-1640+HEPES+谷氨酰胺(Invitrogen)的RPMI培养基中在37℃和5％CO

A431-CD47KO细胞系通过pLentiCrispR-v2–CD47KO(pLentiCrispR-v2由FengZhang惠赠(Addgene质粒#52961))的慢病毒转导产生，使用5’cagcaacagcgccgctacca 3’作为CD47 CrispR靶序列。用1μg/mL的嘌呤霉素随后进行有限稀释选择转导的细胞。通过FACS染色选择缺乏CD47表达的克隆。

将FreeStyle

ADCC测定

在37℃和5％CO

抗体和试剂

CD47 mAb克隆B6H12来自eBioscience，小鼠IgG1/k。作为CD47抗体，选择低亲和力(C47A8-CQ)、中等亲和力(5A3-M5)和高亲和力(2.3D11)抗体，记载于WO2014087248A2(5A3-M5)、EP2992089A1，Barbara Swanson等人Sorrento therapeutic(C47A8-CQ)，和creativebiolabs,目录号：HPAB-0097-CN(2.3D11)。

通过将可变区克隆到Lonza表达载体中，产生低-中-高亲和力的抗CD47抗体。使用选择柱，然后通过尺寸排阻柱(GE healthcare)纯化抗体。

为了靶向GD2，使用具有克隆ch14.18的可变结构域的抗GD2抗体。CD20-IgA2如以下中描述的产生：Dechant 2007:J.Immunol.179(5):2936-43和Meyer 2015MABs 8(1):87-98。

具有IgA2.0恒定区的抗体通过引入下列取代和缺失获得：N45.2G、P124R、C92S、N120T、I121L、T122S、C147缺失和Y148缺失，根据IMGT方案编号。此外，可以引入N135Q突变(根据IMGT方案编号)。为了创建IgA3.0恒定区，可以去除3-20个C-末端氨基酸(参见图3E)。

流式细胞术

在每种条件下，在10

数据分析和统计

平均值的标准误差(SEM)使用GraphPadPrism计算。

讨论

此处，我们首次描述了当与具有IgA同种型的第二治疗性抗体组合时，使用抗CD47抗体抑制CD47/SIRPα检查点导致增加的ADCC。该增加既是剂量依赖性的又是亲和力依赖性的(图7B和图9)，并且在Daudi和Ramos靶细胞两者(分别地，图7和图9)以及一组三种不同的神经母细胞瘤细胞系(图10A-图10E)中观察到该增加。

本发明的发现示出IgA癌症免疫疗法被CD47-SIRPα信号传导抑制。靶向CD47-SIRPα信号传导可以用于提高IgA治疗性抗体的抗肿瘤功效，优选地在癌症治疗中。