锌指蛋白ZBTB20的重组腺病毒载体的构建和鉴定

摘要

基因转录水平上的调控对基因的表达至关重要，甚至对机体的发育也起到极大的作用。基因表达的调控过程主要发生在转录水平上，转录因子通过其特定的结构域与染色体或其他蛋白质相结合，起到对基因转录的促进或阻碍作用。锌指蛋白是一类具有手指状结构域的转录因子，在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育、增强植物抗逆性等方面具有重要的作用。锌指蛋白ZBTB20由741个编码氨基酸组成，N端含有POZ结构域（通常介导蛋白间的相互作用），C端含有5个C2H2锌指结构域（通常介导DNA的结合），与已知的POZ锌指蛋白BCL6和PLZF有30-40％的同源性[1]。利用ZBTB20基因特异性敲除小鼠模型，本实验室揭示了ZBTB20基因在个体发育、物质代谢和神经调控等方面有重要的生理功能[2-6]。尽管如此，关于ZBTB20的生物学功能、其调控的下游靶基因以及介导的信号转导通路仍有许多未明之处。
　　重组腺病毒是非整合型双链DNA病毒，因而无插入突变，无致癌性，它具有感染分裂期和非分裂期细胞的能力，且易于构建、浓缩和纯化，出毒率较高。我们前期的研究提示ZBTB20在肝脏物质代谢、肝癌的发展中具有重要作用，因此具有肝脏靶向性的腺病毒表达载体无疑是我们进一步研究ZBTB20在肝脏的生物学功能及其作用机制的首选工具，于是我们构建了ZBTB20的过表达腺病毒和干扰腺病毒两种重组腺病毒，以便从正反两方面进行ZBTB20的生理和病理功能的研究。
　　我们将带有FLAG标签的ZBTB20的cDNA片段（ZBTB20-FLAG）克隆至pAdTrack-CMV载体，并转化至细菌内，使该重组载体与AdEasy质粒进行同源重组，从而获得重组腺病毒载体Ad-ZBTB20。之后转染293细胞进行包装，并进行三轮扩增，经浓缩纯化后检测病毒滴度。我们利用ZBTB20肝脏特异性敲除小鼠的原代肝细胞和肝脏组织模型，于离体和在体两个水平鉴定所制备的重组腺病毒Ad-ZBTB20介导的ZBTB20 RNA和蛋白的表达情况;并利用报告基因技术检测过表达的ZBTB20蛋白的功能活性。另一方面我们将CMV-ZBTB20shRNA片段克隆至pAdTrack-CMV载体，同样将该重组载体与AdEasy质粒进行细菌内同源重组，从而获得重组腺病毒载体Ad-ZBTB20 shRNA。之后转染293细胞进行包装，并进行三轮扩增，经浓缩纯化后检测病毒滴度。我们采用ZBTB20正常表达小鼠的原代肝细胞和肝脏组织模型，于离体和在体两个水平鉴定所制备的重组腺病毒Ad-ZBTB20shRNA对内源性ZBTB20 RNA和蛋白的干扰效果。
　　最后结果表明本研究所构建的Ad-ZBTB20重组腺病毒可以介导ZBTB20的过表达并具备转录调节活性，Ad-ZBTB20 shRNA重组腺病毒能干扰ZBTB20的表达，为今后研究ZBTB20的相关生物学功能奠定了基础。