血根碱引起的药物—药物相互作用及抗恶性黑素瘤转移的研究

摘要

背景:血根碱是一种具有抗微生物、抗炎等多种生物学活性的生物碱，因其对多种人类肿瘤细胞系有较强的抑制作用而被推荐为抗癌候选药物。鉴于对中药单体的毒性和药效活性评价是其成药的两大前提因素，因此本研究拟对血根碱的毒性和抗癌活性进行深入的探讨。药物的毒副作用已经被大量文献报道，其产生毒性存在种属差异。血根碱对细胞色素P450酶的抑制与其毒性相关。恶性黑素瘤是高度恶性皮肤肿瘤，可发生早期血行转移，脑和肺等是其主要侵袭、转移器官，该类疾病手术治疗困难，且预后极差。恶性黑素瘤恶性程度高、转移发生早。理想的抗恶性黑素瘤的药物最好既能有效的抑制原发肿瘤的增殖，又能抑制其转移。目前用于抗肿瘤药物筛选的体外模型主要是平面培养，即二维模型。细胞二维培养模型存在一些缺陷:缺乏真实的肿瘤组织的微环境，缺少细胞外基质的支持，肿瘤细胞的贴壁生长使其丧失了某些生物学特性。
　　目的:
　　1.研究血根碱是否会诱发经CYP酶抑制的药物-药物相互作用。
　　2.研究血根碱是否能够抑制人恶性黑色素瘤细胞株451LU的粘附、侵袭、转移能力。
　　3.建立一种人恶性黑色素瘤细胞株451LU的三维培养模型，对其形态学及功能学进行初步评价，并在此基础上对血根碱的抗肿瘤活性再次进行评价。
　　方法:
　　1.通过CYP探针底物反应，对血根碱对CYP酶各个亚型的抑制能力进行评价，继而通过单点失活实验、抑制动力学实验进行可逆和基于时间依赖的抑制动力学参数测定，根据FDA推荐的预测公式推导出体内血根碱药物-药物相互作用程度的预测。
　　2.用SRB法检测不同浓度血根碱对恶性黑素瘤细胞细胞活力的影响，通过Annexin-Ⅴ/PI双染流式细胞术检测目标浓度血根碱对恶性黑色素瘤细胞细胞活力的影响。通过transwell肿瘤细胞侵袭实验、细胞伤口愈合实验、基质-细胞粘附实验、内皮细胞增殖实验来检测血根碱对恶性黑色素瘤细胞侵袭、转移、粘附及对内皮细胞增殖的抑制作用。通过realtimePCR，Westernblot来检测肿瘤转移、粘附、血管生成相关基因和蛋白的影响。WesternBlot法检测血根碱对恶性黑索瘤细胞的FAK信号通路的影响。
　　3.将人恶性黑色素瘤细胞株451LU种植于鼠尾胶原中，使细胞在三维立体条件下生长。通过组织学染色、细胞活性分析及免疫荧光染色对细胞的形态学进行评价，通过DNA含量的测定来反映不同培养条件下细胞增殖的情况，通过realtimePCR检测相关基因表达量的差异。通过MTT法评价四种抗癌药物对恶性黑素瘤细胞的细胞活力的影响。
　　结果:
　　1.对血根碱是否会引经CYP酶抑制的药物-药物相互作用进行研究
　　首先考察80μM血根碱对CYP各个亚型催化的探针反应的抑制作用，结果显示对于CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP3A4，血根碱对其活性的抑制超过50％，进一步对其抑制的半数抑制浓度(IC50)进行测定。血根碱对其催化的反应产生浓度依赖型的抑制，IC50值分别为4.5、10.2、7.2和3.4μM。选择不同血根碱浓度和探针底物浓度对抑制CYP1A2，CYP2C8，CYP2C9，CYP34的可逆抑制类型和抑制动力学参数进行了测定。用Lineweaver-Burk作图方法来判断可逆抑制类型，用二次作图来计算抑制动力学参数。结果表明，血根碱对CYP1A2，CYP3A4和CYP2C9的抑制类型属于竞争性抑制，而对CYP2C8属于非竞争性抑制。用Lineweaver-Burk作图中的每条线的斜率对血根碱浓度作图，求得可逆抑制常数Ki，CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP3A4Ki值分别为2.7、8.9、3.8和2.0μM。在单点失活实验中，加入NADPH预孵后的血根碱对CYP1A2、CYP3A4活性的抑制百分比分别增加了25.5％和20.3％，对其它CYP亚型的抑制增加的百分比均小于15％。研究发现，血根碱对CYP1A2，CYP3A4催化的反应体现出时间依赖和NADPH依赖的抑制行为。其对两酶的TDI抑制动力学参数K(l)/kinactvalues分别为13.3/0.087和5.58/0.029min-1μM-1.
　　2.研究血根碱是否能够抑制人恶性黑色素瘤细胞株451LU的粘附、侵袭、转移能力
　　0.02-50μM血根碱可以显著抑制人恶性黑素瘤451-LU细胞的细胞活力，为避免细胞活力因素对后续实验的影响，分别选择安全浓度、低毒浓度和80％细胞活力的三个浓度，即1μM、1.5μM、2μM三个浓度用于后续实验。AnnexinⅤ和PI双染流式细胞术可见1-2μM血根碱对451-LU细胞活力无明显的影响。1-2μM血根碱对451-LU细胞粘附能力均有一定的抑制作用。可以抑制451-LU细胞与基质胶原的粘附作用，且抑制能力呈时间、浓度依赖性。血根碱可以抑制451-LU细胞侵袭、迁移的能力，但各组间未见显著差异。通过SRB方法检测血根碱对人脐静脉内皮细胞增殖的抑制作用，结果显示，nM级别的血根碱可对人脐静脉内皮细胞出现较强的抑制作用。分别选取与肿瘤转移相关的三组蛋白，MMP-2、MMP-2、ICAM-1、VCAM-1、EGF和VEGF-A，将原位恶性黑素瘤WM35与转移株451LU细胞中各蛋白mRNA的表达情况通过realtime-PCR的手段进行检测，结果显示ICAM-1、MMP-2、EGF和VEGF-A的mRNA表达存存显著的增加。1-2μM血根碱均可以抑制ICAM-1，MMP-2，EGF和VEGF-A的mRNA表达。血根碱同样可以抑制ICAM-1，MMP-2蛋白的表达，可以下调FAK及P-FAK的表达。
　　3.人恶性黑素瘤细胞株451LU三维培养模型
　　传统的二维培养中，3天左右细胞出现增殖，5天左右开始出现凋亡，到第7天已经大部分凋亡，而三维培养条件下，451LU细胞呈肿瘤团状增殖，至14天仍可见良好细胞活性。与传统的二维培养相比，三维培养条件下的细胞增殖能力显著增加。显微镜下可见细胞呈球团状生长，晚期（14天）肿瘤团中央可出现缺氧坏死，与在体肿瘤类似。使用MTT的方法对二维培养条件和三维培养条件下阿霉素、长春碱、紫杉醇和血根碱的抗451LU活性进行检测，在三维培养条件下，阿霉索、长春碱和血根碱各组的IC50值存在不同程度的提升，而紫杉醇组仍旧未检测到抗癌活性。在三维培养条件下，分别选取在二维培养条件下出现显著差异的ICAM-1、MMP-2、EGF和VEGF-A，及其在恶性黑素瘤中存在高表达的WT1、BRAF-V600E，与药物吸收相关的P-gp，与肿瘤细胞脱落相关的KLK7，研究结果发现，在三维培养条件下，MMP2、ICAM-1、BRAF-V600E、p-gp的mRNA表达出现显著的增加。
　　结论:
　　1.血根碱对CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9产生了竞争性的可逆抑制作用，对CYP2C8产生了非竞争性的可逆抑制作用。血根碱还对CYP1A2和CYP3A4产生了时间依赖性的抑制。血根碱与CYP1A2、CYP3A4、CYP2C8和CYP2C9的底物共用时可能诱发严重药物-药物相互作用。
　　2.血根碱可以显著抑制人恶性黑素瘤451LU细胞增殖能力。同时，血根碱可抑制黑素瘤的侵袭转移及血管生成的能力，其抑制侵袭转移的能力可能与下调MMP2、ICAM1、VEGF、EGF的基因、蛋白表达水平相关，血根碱可以下调FAK及磷酸化FAK的表达。
　　3.黑素瘤451LU细胞在三维培养模式下生长形态发生改变，三维培养的451LU细胞增殖能力较二维显著提高，三维培养的451LU细胞对药物敏感程度下降，三维培养条件下MMP2、ICAM1、p-gp、BRAF-V600E的基因表达水平升高。

目录

声明

摘要

第一部分 血根碱对人肝细胞色素P450酶的抑制研究

(一)前言

(二)材料和方法

1．试剂

2．实验仪器

3．HLMs的孵育体系

4．血根碱对各个亚型CYP酶的可逆抑制(reversible inhibiton，RI)

5．血根碱对各个亚型CYP酶基于时间依赖的抑制(time-dependent inhibiton，TDI)

6．血浆游离分数的测定

7．基于体外数据预测体内抑制程度

(三)结果

1．血根碱对各个亚型CYP酶的可逆抑制

2．血根碱对各个亚型CYP酶基于时间依赖的抑制

3．体内DDI的预测

(四)讨论

(五)结论

参考文献

第二部分 血根碱对人恶性黑素瘤451LU细胞粘附侵袭、转移能力的影响

(一)前言

(二)材料与方法

1．材料

2．实验方法

(三)实验结果

1．SRB法检测血根碱对451LU细胞细胞活力的影响

2．流式细胞仪检测1μM、1．5μM、2μM血根碱对451LU细胞细胞活力的影响

3．血根碱对451LU细胞粘附能力的影响

4．血根碱对451LU细胞迁移能力的影响

5．血根碱对451LU细胞侵袭能力的影响

6．血根碱对内皮细胞增殖能力的影响

7．WM35及451LU细胞MMP-2、MMP-9、ICAM-1、VCAM-1、EGF、VEGF-A、VEGF-D、VEGF-r2 mRNA表达的差异

8．血根碱对451LU细胞MMP-2、ICAM-1 mRNA及蛋白表达的影响

9．血根碱对451LU细胞FAK及p-FAK蛋白表达的影响

(四)讨论

(五)总结

参考文献

第三部分 人恶性黑素瘤细胞三维培养模型的建立及评价

(一)前言

(二)材料和方法

1．主要试剂及仪器

2．实验方法

(三)结果

1．二维及三维培养条件下，451LU细胞的形态学变化

2．二维及三维培养条件下，生长曲线的变化

3．共聚焦显微镜观察三维培养条件下451LU细胞细胞活力的变化

4．阿霉素、长春碱、紫杉醇和血根碱对二维及三维培养条件下451LU细胞细胞活力的影响

5．二维及三维培养模式下相关基因的表达差异

(四)讨论

(五)总结

参考文献

综述 RAS／RAF／MEK／ERK信号通路在恶性黑素瘤发生中的作用机制及其在靶向治疗中的应用

发表文章、参与课题及科研获奖

致谢