体外培养肿瘤细胞中ANXA7及其下调与共相关蛋白ALG-2、SODD的表达和对细胞增殖迁徙的影响

摘要

背景:
　　细胞失控性增殖和细胞凋亡异常，也就是机体内调节细胞增殖、死亡之间平衡的机制被破坏，是导致恶性肿瘤发生发展的重要原因。原发性肝癌属于上皮来源恶性肿瘤，是我国常见的恶性肿瘤之一，也是恶性程度最高的肿瘤之一，现在首选治疗方法是根治性手术，但是术后五年的转移率和复发率仍居高不下。无限度的增殖、转移和侵袭是恶性肿瘤的最主要特征。其中迁徙和转移潜能是最重要的标志之一。肝癌具有高转移潜能而其转移方式分为血道转移、淋巴道转移和种植转移，也是病患预后差、死亡率高的最重要影响因素，但对于肝癌淋巴道转移及其相关问题的研究，特别是对其所涉基因和蛋白质表达调控变化的特点，和对肿瘤细胞增殖与迁徙能力的影响，迄今报道仍然很少见。众所周知，蛋白是细胞功能的执行者，但它们并不能独自发挥功能而是和其它蛋白或亚基相互调节共同作用。因此研究蛋白之间的相互关联对探讨蛋白质的作用机制有重要裨益，更有利于降低恶性肿瘤病患复发率及死亡率，为临床应用提供新的治疗思路。
　　目的:
　　本实验通过蛋白质免疫沉淀技术和免疫荧光技术确定肿瘤细胞内死亡结构域沉默子(Suppressor Of Death Domains，SODD)和凋亡相关基因2(apoptosis-linked gene-2 protein，ALG-2)为膜联蛋白A7(Annexin A7，ANXA7)的共相关蛋白，对比观察下调小鼠肝癌Hca-P细胞ANXA7基因表达对ALG-2、SODD基因及蛋白表达水平的影响，进而分析ANXA7与共相关蛋白SODD、ALG-2间的作用机制。
　　方法:
　　利用蛋白质免疫沉淀技术，验证在真核细胞内SODD和ALG-2是否为ANXA7的共相关蛋白。采用细胞免疫荧光技术，ANXA7、ALG-2、SODD三种蛋白在细胞内的共定位。构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA7和pGPU6/GFP/Neo-shRNA-NC表达载体，转染至Hca-P细胞，得到PAnxa7下调细胞、PAnxa7无关序列细胞。应用即时荧光定量PCR技术在mRNA水平、蛋白质免疫印迹技术在蛋白质水平上，共同验证体外Hca-P细胞、PAnxa7下调细胞、PAnxa7无关序列细胞中ANXA7的表达，分析ANXA7水平下调对其共相关蛋白SODD、ALG-2转录和翻译是否存在影响。利用Transwell实验观察Hca-P组、PAnxa7下调组、PAnxa7无关序列组细胞穿透小室膜的细胞数，验证下调ANXA7对肿瘤细胞迁徙、转移的影响。CCK8实验分别测得在0小时、24小时、48小时、72小时的光密度值，验证下调ANXA7对肿瘤细胞增殖的影响。
　　结果:
　　蛋白质免疫共沉淀研究发现，在小鼠的Hca-P细胞中，SODD、ALG-2蛋白条带出现在加入ANXA7抗体组，而加入Normal IgG对照时未出现SODD、ALG-2蛋白条带，说明ANXA7与ALG-2、SODD在Hca-P细胞内为共相关蛋白。细胞免疫荧光结果表明，ANXA7及ALG-2在细胞浆邻近细胞膜处共定位，ANXA7及SODD也在细胞浆内共定位表达。在mRNA水平上成功转染的PAnxa7下调组与PAnxa7无关序列组相比，ANXA7的基因表达下降至原基因水平的21％，ALG-2下降至原基因水平的16％，SODD下降至原基因水平的10％。在蛋白质水平上PAnxa7下调组与PAnxa7无关序列组相比，ANXA7的表达下降至原蛋白水平的23％，ALG-2下降至原蛋白水平的21％，SODD下降至原蛋白水平的28％。这些结果充分表明，ANXA7表达受到抑制后，SODD、ALG-2蛋白的表达也明显降低。Transwell细胞转移实验表明，PAnxa7下调组穿透小室膜的细胞数目平均是35.5±3.11，PAnxa7无关序列组穿透小室膜的细胞数目平均是96..25±2.22，Hca-P组穿透小室膜的细胞数目平均是107.25±4.57，提示ANXA7表达下调后，穿透小室膜的肿瘤细胞数目显著减少。Transwell细胞侵袭实验表明，PAnxa7下调组穿透小室膜的细胞数目平均是21.34±3.21，PAnxa7无关序列组穿透小室膜的细胞数目平均是80.33±8.62，Hca-P组穿透小室膜的细胞数目平均是84±3.61，提示ANXA7表达下调后，穿透基质胶的肿瘤细胞数目显著减少。CCK8实验分别测得在0小时、24小时、48小时、72小时三种细胞的吸光度值，Hca-P细胞分别为0.103±0.011、0.167±0.013、0.462±0.027、0.537±0.026; PAnxa7下调组细胞分别为0.105±0.009、0.133±0.011、0.241±0.017、0.301±0.010; PAnxa7无关序列组细胞分别为0.106±0.015、0.158±0.016、0.413±0.021、0.494±0.018，提示PAnxa7下调细胞增殖速度比Hca-P细胞、PAnxa7无关序列细胞慢。
　　结论:
　　在小鼠Hca-P细胞中ANXA7与SODD、ALG-2为共相关蛋白;ANXA7与ALG-2多在胞浆内邻近胞膜处互相结合，ANXA7与SODD多在胞浆中互相结合;并且SODD、ALG-2的基因水平和蛋白水平都随着ANXA7的下调而减少;当Hca-P细胞中ANXA7下降后，肿瘤细胞的增殖能力、迁徙能力和侵袭能力明显下降;ANXA7与SODD、ALG-2可能共同参与了这一系列的生物学活动。